李 喬 馬紀(jì)兵 余群力,* 韓 玲

(1 廣東理工學(xué)院，廣東 肇慶 526100；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

動(dòng)物宰后，肌細(xì)胞會(huì)在缺血、缺氧等應(yīng)激條件下通過一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)催化產(chǎn)生一氧化氮(intric oxide, NO)[1]。NO作為一種氣體信號(hào)分子廣泛存在于肌肉組織內(nèi)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)[2]。研究報(bào)道，NO和一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)之間存在聯(lián)系。正常生理狀態(tài)下，NO通過增加胞內(nèi)Ca2+水平，提高AMPK活性[3]。Vitor等[4]使用NO供體對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)p-AMPK表達(dá)升高，結(jié)果確定AMPKα1亞型是NO誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞效應(yīng)的介質(zhì)。NO供體是AMPK有效的激活劑，但在NOS抑制劑存在的條件下，這種激活作用明顯減弱[5-6]，說明在活體動(dòng)物細(xì)胞中NO對(duì)AMPK具有重要調(diào)節(jié)作用。

肌肉宰后供氧中斷，有氧呼吸作用停止，糖酵解反應(yīng)開始。已有研究證實(shí)，宰后AMPK促進(jìn)糖酵解進(jìn)程，促使乳酸積累，pH值降低，最終影響肉品質(zhì)[7-8]。當(dāng)pH值下降至最小時(shí)，肌肉達(dá)到最大化僵直，此時(shí)肉的蛋白特性和各項(xiàng)品質(zhì)均較差[9]。pH值不僅可以評(píng)估宰后肌肉的成熟進(jìn)程，其高低還會(huì)影響肌肉蛋白特性，進(jìn)而影響肉品質(zhì)[10]，當(dāng)pH值接近蛋白等電點(diǎn)時(shí)，肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白等發(fā)生收縮，游離水增加，此時(shí)肉的嫩度和保水性變差。此外，肌原纖維蛋白的水解程度也會(huì)影響肉品嫩度和保水性[11]。Farouk等[12]發(fā)現(xiàn)動(dòng)物宰后肌原纖維蛋白的水解會(huì)影響蛋白功能特性，如提高溶解度、改善肉品質(zhì)等；Choe等[13]也提出宰后肌原纖維蛋白功能特性的改變對(duì)改善肉品質(zhì)和加工性能有很大作用?？梢?，動(dòng)物宰后AMPK活性對(duì)肉的蛋白特性和品質(zhì)具有重要影響。

然而，肌肉宰后成熟過程中，NO是否調(diào)控AMPK活性，以及NO通過AMPK途徑對(duì)肌肉蛋白特性和肉品質(zhì)造成何種影響，尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以牛臀股四頭肌為研究對(duì)象，經(jīng)過L-NAME(NOS抑制劑，抑制NO生成)、Compound C(AMPK抑制劑)處理，在不同成熟時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定NO-AMPK通路、蛋白功能特性、肉品質(zhì)及肌肉微觀結(jié)構(gòu)等相關(guān)指標(biāo)，以期揭示宰后成熟過程中NO-AMPK通路對(duì)牛肉蛋白特性及肉品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取健康、發(fā)育正常、平均年齡3～4歲的西門塔爾雜交公牛6頭，體重為600±30 kg，購(gòu)自甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司。參考國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物福利的相關(guān)要求，嚴(yán)格按照《GB/T 19477-2018畜禽屠宰操作規(guī)程 ?！穂14]屠宰方式進(jìn)行操作。動(dòng)物屠宰放血后(45 min內(nèi))取臀股四頭肌，剔除表面的脂肪和結(jié)締組織備用。

1.2 主要儀器

HI99163型便攜式pH計(jì)，意大利哈納HANNA儀器公司；SPectramax M2型酶標(biāo)儀，美國(guó)美谷分子儀器有限公司；DSC25型差示掃描量熱儀，美國(guó)TA儀器公司；JSM-6701F型掃描電子顯微鏡，上海立泛機(jī)電設(shè)備技術(shù)有限公司；TX.XT express型質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System公司；JSM-6701F型低真空掃描電子顯微鏡，日本電子光學(xué)公司；C-LM4型肌肉嫩度儀，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將肉樣切割成約60 g(2 cm×4 cm×10 cm)左右的肉塊，隨機(jī)分為3個(gè)組：1)NOS抑制組，20 mmol·L-1L-NAME；2)AMPK抑制組，40 μmol·L-1Compound C；3)Control組，0.86% NaCl(生理鹽水)。其中，L-NAME主要作用于NOS，可以減少機(jī)體內(nèi)NO產(chǎn)生；Compound C作為AMPK抑制劑，可以有效抑制AMPK活性。本試驗(yàn)首先通過L-NAME組與Control組中的NO含量對(duì)比，確定L-NAME是否可以改變肌肉中NO含量，再通過L-NAME組、Compound C組和Control組的對(duì)比，確定NO通過AMPK對(duì)肌肉中蛋白特性和肉品質(zhì)的影響。為加速處理液滲透至樣品中，用20 G針均勻穿刺肉樣。肉樣與處理液浸泡比例為1∶1(g∶mL)，在4℃條件下于保鮮盒中浸泡12 h后取出，用濾紙吸取表面水分，然后于4℃條件下成熟，分別在成熟時(shí)間點(diǎn)0、6、12、24、48、72、120 h取出肉樣進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于不便立即測(cè)定的指標(biāo)，將肉樣存放在-80℃超低溫冰箱待用。每個(gè)指標(biāo)的測(cè)定至少重復(fù)3次。

1.3.2 NO含量測(cè)定 取肉樣1.0 g左右，放入50 mL離心管中，按1∶9(g∶mL)加入勻漿介質(zhì)(0.86%生理鹽水)，10 000 r·min-1勻漿多次。在4℃、4 000 r·min-1條件下離心10～15 min，棄沉淀取上清液在550 nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值。具體操作步驟和計(jì)算公式參照一氧化氮(NO)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：A013-2-1，南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行。

1.3.3 AMPK活性測(cè)定 參考Underwood等[15]的方法。取肉樣0.6 g左右于10 mL離心管中，1∶5(g∶mL) 加入勻漿液冰浴勻漿，4℃、12 000 r·min-1條件下離心5 min，取上清液在450 nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值。具體操作步驟參照牛(Bovine)磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)說明書進(jìn)行。

1.3.4 牛肉蛋白特性測(cè)定

1.3.4.1 蛋白溶解性的測(cè)定 肌漿蛋白質(zhì)溶解性：參照J(rèn)oo等[16]的方法測(cè)定。取1.0 g肉樣置于50 mL離心管中，加入10 mL預(yù)冷的0.025 mol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH值7.2)，冰浴條件下10 000 r·min-1勻漿30 s，勻漿多次，4℃下振蕩抽提12 h。然后進(jìn)行離心處理(1 500 r·min-1，4℃，20 min)，取上清液用雙縮脲法測(cè)定其蛋白含量。

總蛋白質(zhì)溶解性：取1.0 g肉樣置于50 mL離心管中，加入20 mL經(jīng)預(yù)冷的0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH值7.2)，其中含有1.1 mol·L-1碘化鉀，冰浴條件下10 000 r·min-1勻漿30 s，勻漿多次，低溫狀態(tài)下振蕩抽提12 h。然后進(jìn)行離心處理(1 500 r·min-1，4℃，20 min)，用雙縮脲法測(cè)定上清液中蛋白含量。

肌原纖維蛋白溶解性按以下公式計(jì)算：

肌原纖維蛋白溶解性=總蛋白溶解性-肌漿蛋白溶解性。

1.3.4.2 肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)提取 參考Xiong等[17]的方法并稍作修改。按照1∶10(m∶v)加入勻漿液(0.1 mol·L-1KCl，0.002 mol·L-1MgCl2和EGTA，20 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液，pH值6.8)勻漿，4℃、4 427 r·min-1離心15 min，取沉淀，重復(fù)上述步驟2次得到粗MP。用8倍體積緩沖液(0.1 mol·L-1KCl，2 mmol·L-1MgCl2和EGTA，20 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液，1% Triton-100，pH值6.8)洗2次，最后用多倍體積的100 mmol·L-1KCl洗2次得到較高純度的MP。采用雙縮脲法測(cè)定其蛋白濃度。

1.3.4.3 肌原纖維蛋白表面疏水性測(cè)定 參考文獻(xiàn)[18]的方法。取2 mL 1 mg·mL-1蛋白溶液，加入40 μL 1 mg·mL-1溴酚藍(lán)，振蕩10 min，4℃、6 483 r·min-1離心15 min，取上清液稀釋10倍，在595 nm處測(cè)定吸光度值。空白對(duì)照為2 mL(20 mmol·L-1，pH值6.8)磷酸鉀緩沖液加入40 μL 1 mg·mL-1溴酚藍(lán)溶液后測(cè)定的吸光度值(optical density,OD)。按照公式計(jì)算溴酚藍(lán)結(jié)合量：

溴酚藍(lán)結(jié)合量=40×(OD空白-OD樣品)/OD樣品。

1.3.4.4 凝膠保水性測(cè)定 根據(jù)李文博等[19]的方法并做修改，用(20 mmol·L-1，pH值6.8)磷酸鉀緩沖液將蛋白濃度調(diào)至40 mg·mL-1，取該溶液5 mL裝入平底離心管中，25℃水浴鍋以 1℃·min-1升至70℃，然后保持20 min，取出冷卻至室溫，在4℃冰箱放置12 h，制得凝膠待用。取出制好的凝膠在室溫下穩(wěn)定30 min，稱重為m1；隨后4℃、5 000 r·min-1離心15 min，離心后稱重為m2。按照公式計(jì)算凝膠保水性：

凝膠保水性=m2/m1×100%。

1.3.4.5 凝膠硬度測(cè)定 取上述制得的凝膠樣品，在室溫下穩(wěn)定30 min，使用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定其硬度，單位為g，探頭類型：P5；測(cè)前速度：1 mm·s-1；測(cè)中速度：0.5 mm·s-1；測(cè)后速度：0.5 mm·s-1。

1.3.5 差示掃描量熱法(diferential scanning calorimetry，DSC)的測(cè)定 稱取肉樣2 mg左右，放入帶蓋鋁坩堝中，平衡時(shí)間為2 min，以5℃·min-1從20℃升溫至100℃。通過Pyris-12軟件(Perkin-Elmer Instruments，美國(guó))從熱分析圖計(jì)算變性焓(ΔH)和峰值溫度(Tmax，以℃計(jì))。

1.3.6 肉品質(zhì)測(cè)定

1.3.6.1 蒸煮損失測(cè)定 參照王琳琳[20]的方法，稱取肉樣M1裝入蒸煮袋內(nèi)，置于80℃的恒溫水浴鍋中，肉樣中心溫度達(dá)到70℃時(shí)恒溫30 min，取出肉樣冷卻至室溫，測(cè)量樣品質(zhì)量M2。按照公式計(jì)算蒸煮損失率：

蒸煮損失率=(M1-M2)/M1×100%。

1.3.6.2 剪切力測(cè)定 取約50 g左右的肉樣，放入蒸煮袋內(nèi)置于80℃恒溫水浴鍋中，當(dāng)肉樣中心溫度達(dá)到70℃時(shí)維持30 min，取出肉樣放置冷卻，用直徑1.27 cm的取樣器沿著肌纖維方向鉆取肉柱，采用嫩度儀自帶的“V”型剪切刀架測(cè)定。

1.3.7 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 參考文獻(xiàn)[21]的方法，從4%多聚甲醛溶液中取出已固定好的牛肉組織，將肉樣切成2.5 mm ×2.5 mm×3 mm，用酒精梯度脫水、石蠟包埋后切成5 μm的組織切片，固定于載玻片上。組織切片用蘇木精-伊紅染色4 min，二甲苯梯度溶液通透10 min，中性樹膠封片。制備好的玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察，用Images Pro Plus 6.0測(cè)量肌纖維直徑、間距和橫截面積。每幅圖平均選取不少于30個(gè)肌細(xì)胞[22]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

上述各項(xiàng)指標(biāo)至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)全部采用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差，用SPSS 21.0軟件進(jìn)行Duncan’s差異顯著性分析(P<0.05)使用Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉宰后NO含量變化

NO存在于肌肉組織內(nèi)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)。如圖1所示，宰后NO含量呈下降趨勢(shì)，6～72 h L-NAME組NO含量顯著低于對(duì)照組，至120 h，兩組NO含量無顯著差異，但L-NAME組NO含量仍較對(duì)照組低8.21%。由此可見，L-NAME作為NOS的抑制劑，降低了NOS活性，并減少了牛肉宰后成熟過程中的NO含量。

注：不同大寫字母表示同一成熟時(shí)間下不同處理間差異顯著(P<0.05)； 不同小寫字母表示同一處理下不同成熟時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different capital letters indicate significant differences between different treatments at the same maturity time at 0.05 level. Different lowercase letters indicate significant differences at different times under the same treatment at 0.05 level. The same as following.圖1 宰后成熟過程中NO含量的變化Fig.1 Changes in NO content during post-mortem maturation

2.2 牛肉宰后AMPK活性變化

AMPK是細(xì)胞內(nèi)能量平衡的重要感受器與調(diào)節(jié)器。如圖2所示，3個(gè)試驗(yàn)處理組中AMPK活性均隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)先增大后減小，均在6 h達(dá)到最大值，此時(shí)L-NAME組和Compound C組中AMPK活性分別較對(duì)照組降低14.78%和26.75%。0～72 h Compound C組中AMPK活性顯著低于L-NAME組和對(duì)照組，說明L-NAME處理和Compound C處理可有效抑制AMPK活性，進(jìn)一步表明牛肉宰后NO可以提高AMPK活性。

圖2 牛肉成熟過程中AMPK活性變化Fig.2 Changes of AMPK activity during bovines postmortem aging

2.3 牛肉宰后pH值變化

宰后pH值的變化對(duì)肉品質(zhì)起著重要作用，最終影響肉的嫩度和保水性。如圖3所示，宰后成熟過程中牛肉pH值呈先減小后增大的趨勢(shì)。成熟至72 h，L-NAME組、Compound C組和對(duì)照組中pH值分別比0 h降低了14.98%、13.03%和15.40%，其中對(duì)照組的pH下降幅度最大。L-NAME組中pH值在6～12 h顯著高于對(duì)照組，Compound C組中pH值在6～120 h顯著高于對(duì)照組。同時(shí)，Compound C組pH值在12、72 h顯著高于L-NAME組。以上結(jié)果說明，NO可以通過提高AMPK活性促進(jìn)糖酵解，進(jìn)而促進(jìn)pH值的下降。

圖3 牛肉成熟過程中pH變化Fig.3 Changes of pH during bovines postmortem aging

2.4 牛肉宰后蛋白特性變化

2.4.1 蛋白溶解度變化 如圖4-A所示，L-NAME組和對(duì)照組中總蛋白溶解性在0～120 h先下降后上升，Compound C組在6～120 h先下降后上升。0～120 h，L-NAME組和Compound C組中總蛋白溶解性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)L-NAME組在6、24 h顯著低于Compound C組。如圖4-B所示，隨著宰后成熟時(shí)間延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白溶解性先減小后增大，L-NAME組和Compound C組中的肌原纖維蛋白溶解性分別在6、72 h和6、24、72、120 h顯著高于對(duì)照組。如圖4-C所示，隨著宰后成熟時(shí)間延長(zhǎng)，3個(gè)處理組中肌漿蛋白溶解性呈先增大后減小的趨勢(shì)，0～120 h L-NAME組和Compound C組顯著高于對(duì)照組，Compound C組在6～24 h、72～120 h顯著高于L-NAME組。以上結(jié)果表明，NO可以通過增加AMPK活性而降低牛肉蛋白溶解度。

圖4 牛肉成熟過程中蛋白溶解性變化Fig.4 Changes of protein solubility during bovines postmortem aging

2.4.2 MP表面疏水性指數(shù) 蛋白表面疏水性指數(shù)越低，其結(jié)合水能力越強(qiáng)[23]。如圖5所示，MP表面疏水性指數(shù)先增大后減小。L-NAME組和Compound C組中MP表面疏水性指數(shù)分別在12、48 h和12～120 h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。3個(gè)處理中對(duì)照組MP表面疏水性指數(shù)最大，其次是L-NAME組，Compound C組最小，這可能是因?yàn)榧尤隠-NAME和Compound C抑制了糖酵解速率，pH值下降速率降低，使得pH值偏離蛋白等電點(diǎn)，溶解性較好，而溶解性與表面疏水性負(fù)相關(guān)，因此對(duì)照組疏水性最大。由此說明宰后NO可通過提高AMPK活性促進(jìn)糖酵解過程，進(jìn)而促使pH值降低，最終使得MP表面疏水性增大。

圖5 牛肉成熟過程中MP表面疏水性變化Fig.5 Changes of surface hydrophobicity index during bovines postmortem aging

圖6 牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白凝膠特性變化Fig.6 Changes of myofibrillar protein gel properties during beef maturation

2.4.3 凝膠特性變化 蛋白質(zhì)凝膠特性也是影響肉品加工的因素之一[24]。如圖6-A所示，隨著宰后成熟時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白凝膠保水性呈先減小后增大的趨勢(shì)，在72 h降至最小值。L-NAME組中凝膠保水性在24～72 h顯著高于對(duì)照組，Compound C組在24～120 h顯著高于對(duì)照組，同時(shí)，Compound C組在72 h顯著高于L-NAME組。如圖6-B所示，3個(gè)處理組中蛋白凝膠硬度均在72 h達(dá)到最大值后下降。其中，Compound C組在6～120 h和12～120 h分別顯著高于對(duì)照組和L-NAME組(P<0.05)。綜上，與L-NAME組和Compound C組比較，對(duì)照組降低了蛋白凝膠保水性和硬度，進(jìn)而說明NO通過AMPK降低了蛋白凝膠保水性和硬度。

2.5 牛肉宰后DSC變化分析

DSC熱相圖中，峰面積可以反映蛋白質(zhì)的變性程度。圖譜中存在2個(gè)峰：峰Ⅰ和峰Ⅱ，分別代表肌球蛋白尾部和肌漿蛋白以及肌動(dòng)蛋白變性引起的熱流變化[25]。由圖7可知，3個(gè)處理組中牛肌肉蛋白的DSC熱流曲線分析均出現(xiàn)了吸熱峰，峰Ⅰ不明顯，峰Ⅱ明顯。表1中三組峰Ⅱ?qū)?yīng)的溫度大小為Compound C組>L-NAME組>對(duì)照組。峰Ⅰ中Compound C組變性焓值在48 h顯著大于L-NAME組，在48～72 h顯著大于對(duì)照組(P<0.05)；峰Ⅱ中Compound C組變性焓值在48～120 h顯著大于L-NAME組，在12～120 h顯著大于對(duì)照組(P<0.05)。與L-NAME組相比，對(duì)照組中蛋白質(zhì)發(fā)生了輕微變性，而與Compound C組比較，對(duì)照組發(fā)生了嚴(yán)重變性。NO通過提高AMPK活性促進(jìn)宰后糖酵解過程，使得pH值降低，而pH值的下降會(huì)降低肌球蛋白的變性溫度點(diǎn)，降低其熱穩(wěn)定性，說明pH值越接近肌原纖維蛋白等電點(diǎn)，肌球蛋白熱穩(wěn)定性越差[26]。因此說明，NO可通過提高AMPK活性促進(jìn)糖酵解過程，促使pH值下降接近蛋白等電點(diǎn)，降低牛肉蛋白熱穩(wěn)定性。

表 1 宰后牛肉蛋白變性溫度與變性焓值的變化Table 1 Changes in denaturation temperatures (Tmax) and denaturation enthalpy (ΔH) of muscle proteins during postmortem aging

注：A：L-NAME組；B：Compound C組；C：Control組。Note: A: L-NAME group. B: Compound C group. C: Control group.圖7 不同處理組中牛肉蛋白DSC圖Fig.7 DSC chart of beef protein in different treatment groups

2.6 牛肉品質(zhì)變化

2.6.1 剪切力變化 如圖8所示，隨著宰后成熟時(shí)間延長(zhǎng)，剪切力呈先增大后減小的趨勢(shì)。在24～48 h L-NAME組顯著高于對(duì)照組，12～120 h Compound C組顯著高于對(duì)照組，12、48、72 h Compound C組顯著高于L-NAME組(P<0.05)。肌肉中的重要蛋白隨著pH值的下降達(dá)到等電點(diǎn)而沉降，肌肉收縮硬化，水分流失增加，嫩度變差，此時(shí)肉樣剪切力增大。與L-NAME組和Compound C組相比，對(duì)照組中牛肉剪切力降低?？梢?，NO可通過提高AMPK活性促進(jìn)糖酵解使得pH值下降，進(jìn)而降低牛肉剪切力值，改善其嫩度。

圖8 牛肉成熟過程中剪切力變化Fig.8 Changes of shear force during bovines postmortem aging

2.6.2 蒸煮損失變化 如圖9所示，3個(gè)處理組中牛肉蒸煮損失先增大后減小，72 h最大。L-NAME組在12～24 h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，Compound C組分別在12～24 h和12、24、72 h顯著低于對(duì)照組和L-NAME 組(P<0.05)。牛肉宰后pH值下降接近蛋白等電點(diǎn)，因此蛋白質(zhì)之間相互吸引，從而對(duì)水分吸引減小，導(dǎo)致蛋白溶解度下降，造成肌肉水分流失[27]。一些儲(chǔ)存水分的蛋白質(zhì)也會(huì)因?yàn)閜H值的降低發(fā)生變性，肌纖維間的間隙增大也會(huì)引起水分流失[28]。以上結(jié)果表明，NO可通過提高AMPK活性促進(jìn)糖酵解使得pH值下降，進(jìn)而增大牛肉蒸煮損失。

圖9 牛肉成熟過程中蒸煮損失變化Fig.9 Changes of cooking loss during bovines postmortem aging

2.7 組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化

肌肉的肌纖維結(jié)構(gòu)與其保水性和嫩度有著密切聯(lián)系，隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)，肌纖維的結(jié)構(gòu)被破壞，造成肌肉水分流失，肉質(zhì)松軟等問題。組織結(jié)構(gòu)圖像結(jié)果如圖10所示，肌纖維的橫截面面積呈逐漸縮小的狀態(tài)，而肌纖維之間的距離逐漸增大。與對(duì)照組中肌纖維的分布狀態(tài)相比，L-NAME組和Compound C組的肌纖維排列較緊密。同時(shí)，隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)，3個(gè)處理組中細(xì)胞邊緣光滑性逐漸減弱，成熟至120 h，肌纖維橫截面積和直徑最小，肌纖維的離散程度最大，間距也最大。

注：A、B、C分別代表L-NAME組、Compound C組、Control組，0、6、12、24、48、72、120分別代表成熟0、6、12、24、48、72、120 h的組織學(xué)形態(tài)。Note: A, B, C represent the L-NAME group, Compound C group, and Control group, respectively. 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 represent mature histological morphology at 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 h.圖10 肌細(xì)胞橫切HE染色成像結(jié)果Fig.10 HE staining imaging results of cross-section of muscle cells

由表2可知，隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，肌細(xì)胞的橫截面積和直徑呈下降趨勢(shì)，而肌細(xì)胞之間的間隙逐漸增大。L-NAME組肌細(xì)胞間隙在6、24～120 h顯著小于對(duì)照組，Compound C組在6～120 h和12～72 h分別顯著小于對(duì)照組和L-NAME組?？傮w上，對(duì)照組的肌細(xì)胞平均橫截面積和直徑小于L-NAME組和Compound C組，同時(shí)，L-NAME組肌細(xì)胞橫截面積小于Compound C組。成熟至120 h，3個(gè)處理組肌纖維間的分隔進(jìn)一步加強(qiáng)。結(jié)合3個(gè)處理組肉樣中剪切力和蒸煮損失的變化得出，NO通過提高AMPK活性促進(jìn)糖酵解促使pH值降低，最終改善了牛肉嫩度，但其保水性變差。

表2 成熟過程中肌細(xì)胞面積及間距的變化Table 2 Changes in cross-sectional area and spacing of muscle cells during maturation

3 討論

NO作為骨骼肌穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑，通過代謝途徑影響肉質(zhì)。本試驗(yàn)中采用L-NAME處理宰后牛肉，顯著降低了牛肉中的NO含量，這與Cottrell等[29]的研究結(jié)果一致。AMPK作為細(xì)胞內(nèi)能量平衡的調(diào)節(jié)器，影響著宰后肌肉代謝過程。為探究NO是否通過AMPK影響牛肉的蛋白特性和肉品質(zhì)，將L-NAME和Compound C處理的肉樣與對(duì)照組肉樣進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)，3個(gè)處理組中AMPK活性先增大后減小，AMPK活性在0～24 h時(shí)對(duì)照組顯著高于L-NAME組、在0～72 h L-NAME組顯著高于Compound C組，說明宰后成熟過程中NO提高了AMPK活性。與前人研究結(jié)果[30-31]類似，Higaki等[30]報(bào)道NO供體可誘導(dǎo)大鼠肌肉中α1-AMPK的磷酸化和激活；Lira等[31]報(bào)道，在大鼠體內(nèi)和體外試驗(yàn)中，NOS和AMPK之間存在正反饋?zhàn)饔谩Ｔ缀蠹∪庵蠥MPK促進(jìn)糖酵解過程，促使pH值降低，本試驗(yàn)中，pH值隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后減小，對(duì)照組中pH值整體低于L-NAME組、L-NAME組中pH值整體低于Compound C組，說明NO通過AMPK促進(jìn)糖原分解，使得宰后牛肉糖原含量降低，乳酸含量升高，pH值下降。

肌肉中蛋白質(zhì)處于高度溶解狀態(tài)時(shí)才能夠表現(xiàn)出肌肉蛋白的功能特性。蛋白溶解度作為評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)變性程度的重要指標(biāo)之一，是其發(fā)揮功能特性的前提[32]。蛋白溶解度受pH值的影響，當(dāng)pH值偏離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白具可溶性；當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白產(chǎn)生沉淀，溶解性變差。本試驗(yàn)結(jié)果中，隨著宰后成熟時(shí)間延長(zhǎng)，牛肉pH值在48～72 h附近接近等電點(diǎn)，此時(shí)蛋白溶解性表現(xiàn)出較低水平，這與惠小洋[22]研究中牛肉蛋白溶解性變化結(jié)果一致。對(duì)照組中pH值隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)下降較快，接近等電點(diǎn)，而Compound C組中pH值下降速率最慢，因此本試驗(yàn)中Compound C組蛋白溶解性最大，對(duì)照組最小。蛋白疏水作用對(duì)肉品質(zhì)的影響是間接的[33]。本試驗(yàn)中，3個(gè)處理組中隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)，MP表面疏水性先增大后減小，可能是肌肉解僵成熟時(shí)MP的溶解性增加和肌肉疏水性基團(tuán)減少的結(jié)果[34]，這與郭兆斌等[33]的結(jié)果一致。有研究表明，蛋白溶解度與凝膠保水性呈正相關(guān)性[35]，分析本試驗(yàn)中凝膠保水性和凝膠硬度變化趨勢(shì)的原因，可能是0～72 h時(shí)總蛋白質(zhì)溶解度下降、疏水性升高，導(dǎo)致凝膠保水性下降、硬度提高；而在120 h總蛋白溶解度回升、疏水性下降，改善了凝膠保水性和硬度。?？颂m等[36]提出，當(dāng)pH值在蛋白等電點(diǎn)附近時(shí)，凝膠保水性降低，硬度減??；當(dāng)pH值偏離蛋白等電點(diǎn)時(shí)，分子間凈電荷增加，為水分子提供了更多的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，增大水合作用表面積，使凝膠保水性提高[27,37]。因此，推測(cè)本試驗(yàn)3個(gè)處理組中凝膠保水性和硬度的差異是由不同pH值造成的[35]。NO通過提高AMPK活性加速糖酵解，從而促進(jìn)肌纖維結(jié)構(gòu)破壞及牛肉宰后成熟，因此，對(duì)照組蛋白結(jié)構(gòu)破壞最嚴(yán)重，熱穩(wěn)定性最差；Compound C組蛋白最不容易被破壞，熱穩(wěn)定性最好。

嫩度和保水性也是判斷肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。剪切力值的結(jié)果顯示，與L-NAME組相比，對(duì)照組的牛肉剪切力值減小，說明NO會(huì)降低牛肉的剪切力值，這與Cook等[38]研究結(jié)果一致。肌肉嫩度與組織結(jié)構(gòu)(肌纖維密度、肌纖維直徑、肌纖維面積)也有緊密關(guān)系[39]，本試驗(yàn)中，牛肉肌細(xì)胞的直徑和橫截面積表現(xiàn)為Compound C處理>L-NAME處理>對(duì)照組。已有研究表明，骨骼肌纖維細(xì)胞的直徑和面積越大，肉的嫩度越差[40]，本研究結(jié)果與之一致。宰后牛肉成熟過程中，低pH值會(huì)導(dǎo)致一些儲(chǔ)存水分的肌原纖維蛋白發(fā)生變性，破壞維持水分空間的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[41]，從而影響肌肉的持水性。蒸煮損失的結(jié)果顯示，Compound C處理的牛肉蒸煮損失小于L-NAME處理，L-NAME處理的牛肉蒸煮損失小于對(duì)照組，分析原因是成熟過程中牛肉pH值先減小后增大，對(duì)照組pH值降低首先達(dá)到蛋白等電點(diǎn)，而Compound C處理的牛肉pH值最后降低到等電點(diǎn)，肌肉中的水分流失會(huì)在pH值接近等電點(diǎn)時(shí)最大[42]。已有研究表明，牛肉pH值下降速率越快，蒸煮損失越嚴(yán)重[43]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述，對(duì)照組牛肉嫩度最好，而保水性最差。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，L-NAME能夠抑制NOS活性，減少體內(nèi)NO的產(chǎn)生，Compound C能有效抑制AMPK活性。相比L-NAME和Compound C處理，經(jīng)生理鹽水處理后的牛肉蛋白溶解性、凝膠保水性和硬度、對(duì)熱穩(wěn)定性均降低，蛋白表面疏水性增大；同時(shí)牛肉蒸煮損失增大，剪切力減小。因此，宰后成熟過程中，NO-AMPK通路降低牛肉蛋白溶解性，促進(jìn)蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而使得肉品保水性變差，但是其嫩度有所改善。綜上所述，NO-AMPK作為影響宰后牛肉蛋白特性和肉質(zhì)的一個(gè)重要調(diào)控途徑，對(duì)未來牛肉成熟過程中肉品質(zhì)的改善研究具有一定借鑒作用。