楊永環(huán) 劉東 湯曉陽(yáng) 王興媛

摘 要：本文測(cè)定了3個(gè)不同廠家的醫(yī)用羧甲基殼聚糖的等電點(diǎn)，驗(yàn)證了《醫(yī)用羧甲基殼聚糖》（YY 0953—2015）中等電點(diǎn)測(cè)定方法的可行性和可靠性，最后得出結(jié)論，為標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)施提供參考。

關(guān)鍵詞：羧甲基殼聚糖;等電點(diǎn);醫(yī)用;測(cè)定方法

Abstract： This paper determined the isoelectric point of medical carboxymethyl chitosan from three different manufacturers， and verified the feasibility and reliability of the isoelectric point determination method in "Medical Carboxymethyl Chitosan" （YY 0953—2015）， finally drawn a conclusion to provide a reference for the implementation of standard methods.

Keywords： carboxymethyl chitosan;isoelectric point;medical;determination method

殼聚糖可由甲殼素脫乙酰化得到，是自然界中廣泛存在的堿性多糖，殼聚糖具有生物可降解性強(qiáng)、生物相容性好、細(xì)胞毒性低和儲(chǔ)量大等特征[1]。作為一種生物糖類聚合物，它是促進(jìn)軟組織修復(fù)的生物材料，廣泛應(yīng)用于皮膚傷口愈合、引導(dǎo)骨和軟骨再生以及骨關(guān)節(jié)炎的治療[2-3]。

由于殼聚糖不溶于水和有機(jī)溶劑，只溶于稀酸，因此殼聚糖的應(yīng)用受到限制。羧甲基殼聚糖是殼聚糖最重要的衍生物之一，羧甲基殼聚糖相比殼聚糖有更好的生化及物理特性，并且溶解性更好，尤其是在中性和堿性溶液中，其溶解性顯著增強(qiáng)，使其具有成膜、增稠、保濕、螯合等特性，因而能夠廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。在醫(yī)療器械行業(yè)中，目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的產(chǎn)品有殼聚糖護(hù)創(chuàng)海綿、外用殼聚糖抗菌液、殼聚糖敷料等。羧甲基殼聚糖溶液對(duì)pH敏感，存在等電點(diǎn)，在試驗(yàn)的過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)，同是羧甲基殼聚糖，但不同廠家產(chǎn)品的等電點(diǎn)有很大的差異。本文詳細(xì)介紹了羧甲基殼聚糖等電點(diǎn)的測(cè)定，目的為驗(yàn)證《醫(yī)用羧甲基殼聚糖》（YY 0953—2015）中等電點(diǎn)試驗(yàn)方法的可行性和可靠性。

1 試驗(yàn)流程

1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)樣品有三種。一是醫(yī)用羧甲基殼聚糖，產(chǎn)自煙臺(tái)萬(wàn)利醫(yī)用品有限公司;二是羧甲基殼聚糖，產(chǎn)自賽克賽斯生物科技股份有限公司;三是羧甲基殼聚糖，產(chǎn)自石家莊億生堂醫(yī)用品有限公司。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器包括：電子分析天平，梅特勒-托利多XPE205;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Agilent Cary 60;多參數(shù)測(cè)定儀，梅特勒-托利多;恒溫磁力攪拌器，鞏義市予華ZNCL-BS230;離心機(jī)：SIGMA 3-30K。主要試劑為鹽酸。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試液制備。分別稱取羧甲基殼聚糖0.50 g和1.00 g，將其置于兩個(gè)500 mL燒杯中，加蒸餾水300 mL，攪拌，完全溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1%和0.2%的溶液。

1.3.2 供試液pH梯度調(diào)節(jié)。將供試液分裝在10個(gè)100 mL燒杯中，每杯為30 mL，用恒溫磁力攪拌器不斷攪拌，緩慢向其中滴加0.05 mol/L的鹽酸，用pH計(jì)連續(xù)測(cè)定溶液pH，調(diào)節(jié)每杯pH分別為5.2、5.0、4.8、4.6、4.4、4.2、4.0、3.8、3.6、3.4，然后用濾紙過(guò)濾掉不溶物或離心，以蒸餾水為空白，測(cè)定濾液250 nm處的透光率。

1.3.3 結(jié)果處理。以透光率為縱坐標(biāo)，pH值為橫坐標(biāo)，繪制T-pH曲線，觀察透光率發(fā)生突變的點(diǎn)，羧甲基殼聚糖的等電點(diǎn)為透光率突躍為最大的pH值。

2 檢測(cè)結(jié)果

2.1 煙臺(tái)萬(wàn)利樣品數(shù)據(jù)

在不同pH的條件下，質(zhì)量濃度0.1%和0.2%的樣品在250 nm處的透光率如表1所示。質(zhì)量濃度為0.2%的樣品，在pH為5.2～4.6時(shí)，溶液呈透明凝膠狀，用濾紙很難過(guò)濾，在pH為4.4時(shí)，溶液流動(dòng)性變好。質(zhì)量濃度0.1%的樣品，在pH值為5.2～4.6時(shí)，溶液呈透明凝膠狀，用濾紙也不容易過(guò)濾，但稍好于質(zhì)量濃度為0.2%的樣品。所以，用紫外分光光度計(jì)測(cè)透過(guò)率時(shí)，本研究只過(guò)濾了pH為4.4～3.4的樣品。由圖1可以看出，在0.1%和0.2%的質(zhì)量濃度下，煙臺(tái)萬(wàn)利樣品的透光率均在pH=3.6時(shí)發(fā)生突變，其等電點(diǎn)為3.6。

2.2 賽克賽斯樣品數(shù)據(jù)

在不同pH的條件下，質(zhì)量濃度0.1%和0.2%的樣品在250 nm處的透光率如表2所示。不管是質(zhì)量濃度為0.1%還是0.2%，在不同pH下，塞克塞斯樣品用濾紙均難過(guò)濾，所以本研究采用離心后來(lái)測(cè)不同pH條件下的透光率。由圖2可以看出，在質(zhì)量濃度為0.1%和0.2%的條件下，塞克塞斯樣品的透光率均在pH=4.0時(shí)發(fā)生突變，但是與煙臺(tái)萬(wàn)利樣品相比，透光率突變不是太明顯。

2.3 石家莊億生堂樣品數(shù)據(jù)

在不同pH的條件下，不同質(zhì)量濃度在250 nm處的透光率如表3所示。由圖3可以看出，在0.1%和0.2%的質(zhì)量濃度下，石家莊億生堂樣品的透光率均在pH=4.0時(shí)發(fā)生突變。

3 驗(yàn)證結(jié)論

3.1 樣品質(zhì)量濃度

在質(zhì)量濃度為0.05%～0.5%時(shí)，根據(jù)三個(gè)樣品的滴定情況，筆者發(fā)現(xiàn)，羧甲基殼聚糖質(zhì)量濃度不能太大。煙臺(tái)萬(wàn)利和石家莊億生堂樣品質(zhì)量濃度適宜保持在0.1%～0.3%，賽克賽斯樣品質(zhì)量濃度適宜保持在0.1%～0.2%。

3.2 鹽酸的濃度

在調(diào)節(jié)pH時(shí)，筆者試驗(yàn)了不同的鹽酸濃度，所用鹽酸濃度不能大于0.1 mol/L，否則滴定時(shí)形成氣泡包夾溶液，很難攪拌開(kāi)，鹽酸濃度取0.05 mol/L較為合適。

3.3 過(guò)濾

調(diào)節(jié)好溶液的pH后，用濾紙過(guò)濾掉不溶物，當(dāng)pH較高時(shí)，不同質(zhì)量濃度溶液的過(guò)濾效果稍有差別。例如，在pH為4.2～5.2時(shí)，由于溶液較濃，濾紙很難過(guò)濾掉不溶物。

3.4 離心

調(diào)節(jié)好溶液的pH后，如果選擇離心后測(cè)透光率，那么離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)最后的試驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定影響，本研究選擇的離心條件是6 000 r/min，離心10 min。

3.5 等電點(diǎn)

羧甲基殼聚糖等電點(diǎn)不是固定的，不同廠家的樣品等電點(diǎn)有一定的差別。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kean T，Thanou M.Biodegradation，biodistribution and toxicity of chitosan[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2010（1）：3-11.

[2]于瑪麗，李麗梅，郭家智，等.殼聚糖在組織工程的應(yīng)用[J].中國(guó)高新科技，2019（3）：103-105.

[3]CHEN Z，DENG S，YUAN D C，et al.Novel nano-microspheres containing chitosan，hyaluronicacid，and chondroitin sulfate deliver growth and differentiation factor-5 plasmid for osteoarthritis gene therapy[J].Journal of Zhejiang University Science B ，2018（12）：910-923.