趙玲 崔志華 陳維國 江華 高普 孫巖峰

摘要： 為了深入研究前期工作中發(fā)現(xiàn)的芳伯胺化合物對蠶絲絲素蛋白的修飾作用，選用氨基芳磺酸染料為修飾顯色劑，探討甲醛參與下蠶絲絲素蛋白Mannich反應修飾的電荷效應。文章測定并分析了反應條件下脫膠蠶絲和氨基芳磺酸染料的帶電荷特性，研究了pH值、甲醛、元明粉對Mannich反應修飾效率的影響。研究結果表明，當pH值為4時修飾效率最高，此時脫膠蠶絲織物顯正電性，氨基芳磺酸染料顯負電性，在相反電荷引力作用下發(fā)生物理性吸附，且此時處于弱酸條件下，更有利于發(fā)生Mannich反應修飾。在pH值小于等于4時，元明粉則隨蠶絲的帶電性不同而呈現(xiàn)緩染或在pH值大于等于5時促染作用，但對Mannich反應修飾效率影響較小。

關鍵詞： 蠶絲；等電點；電荷效應；氨基芳磺酸；Mannich反應修飾

中圖分類號： TS190.2文獻標志碼： A文章編號： 1001-7003（2018）03-0021-06引用頁碼： 031104

Abstract： For the further study of the modification effect on silk fibroin protein by aromatic primary amine compounds found in our previous work， the self-synthesized aminoaromatic sulfonic acid dye was used as the color developing agent to discuss the charge effect after Mannich reaction with silk fibroin protein under the existence of formaldehyde. In this paper， the isoelectric points of degummed silk and the aminoaromatic sulfonic acid dye under the reaction conditions were measuredand analyzed. Besides， the effects of pH， formaldehyde and sodium sulfate on Mannich reaction and modification efficiency were studied. It demonstrated that the highest efficiency appeared when pH was 4. Under this condition， the surface of the degummed silk fabric was positively charged， and aminoaromatic sulfonic acid dye showed negative charge， resulting in remarkable physical adsorption under electrostatic attraction. Meanwhile， the dye bath of weak acid was beneficial to the Mannich reaction. Sodium sulfate retarded dyeing （pH≤4） or accelerated dyeing （pH≥5）， and made a little difference on the modification efficiency of the Mannich reaction.

Key words： silk； isoelectric point； charge effect； aminoaromatic sulfonic acid； Mannich reaction modification

蛋白質的側鏈基團修飾主要是通過化學反應引入特定的基團，賦予蛋白質某些功能。在蛋白質側鏈基團的化學修飾反應中，修飾試劑選擇性地與某一特定殘基反應，而不影響蛋白質分子構象，同時蛋白質的聚集態(tài)結構與基礎性能也不發(fā)生改變。蛋白質的側鏈基團修飾所具有的可控性與穩(wěn)定性，已使其成為蛋白質材料功能化研究的一項重要技術手段[1]。

近年來，對蛋白質中含有芳香側鏈的氨基酸殘基進行化學修飾的方法受到學者們的關注，其中通過重氮化偶合反應修飾酪氨酸殘基的修飾方法應用較為廣泛，但是偶合修飾過程中酪氨酸的對亞甲基苯酚側基和芳胺重氮鹽偶合生成的偶氮結構帶有顏色，造成不必要的蛋白質著色問題[2]。相比而言，基于Mannich反應的芳伯胺化合物對蛋白質的修飾則避免了這個問題[3]。該反應主要通過甲醛的橋接作用將酪氨酸分子與芳伯胺化合物連接，避免了偶氮結構發(fā)色體的形成。前期研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，應用該方法可在常溫及弱酸條件下，將含有芳伯胺基團的水溶性染料分子（氨基芳磺酸染料）作為顯色劑引入到蠶絲絲素蛋白分子中，且修飾效率較高。修飾機理如圖1所示。

由于氨基芳磺酸染料和蠶絲絲素蛋白均具有兩性性質，當兩者處于不同pH值水溶液中時，纖維表面和氨基芳磺酸染料的帶電情況會隨pH值的變化而變化，而帶電情況的不同不僅會影響到物理吸附，還會進一步影響化學修飾效率。因此，為了提高化學修飾效率，需要探究合理的修飾條件，一方面提升染料與纖維間的吸引力，使更多的氨基芳磺酸染料吸附到蠶絲纖維上，另一方面修飾條件還需要有利于化學修飾反應的發(fā)生。

為此，本文研究氨基芳磺酸染料對蠶絲的修飾作用過程中的電荷效應，為獲得更好的Mannich反應修飾效率提供理論支持，以期為芳伯胺化合物修飾蠶絲絲素蛋白的應用技術研究打下基礎。

1實驗

1.1材料及儀器

材料：脫膠蠶絲織物為11205電力紡練白坯，平方米質量40g/m2（杭州喜得寶絲綢有限公司），元明粉（AR）（杭州高晶精細化工有限公司），37%的ACS甲醛（上海三鷹化學試劑有限公司），皂片（上海市紡織工業(yè)技術監(jiān)督所），氨基芳磺酸染料C.I.酸性棕4，結構見圖2（杭州下沙恒升化工有限公司），冰醋酸、氯化鉀固體（AR）（杭州高晶精細化工有限公司），N，N-二甲基甲酰胺（AR）（匯普化工儀器有限公司）。

儀器：SurPASS 3固體表面Zeta電位儀（奧地利安東帕有限公司），SF600-PLUS測色配色儀（美國DataColour公司），紫外-可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），ZetaPALS電位儀（美國布魯克海文儀器公司），PHS-3C精密臺式pH計（上海儀電科學儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1蠶絲表面的電荷特性測試

應用固體表面Zeta電位儀對蠶絲表面的Zeta電位進行測試，采用可調狹縫樣品池（10mm×20mm），調節(jié)測試壓力為3×104Pa， gap height調節(jié)至100μm。

1.2.2氨基芳磺酸染料的電荷特性測試

氨基芳磺酸染料分子結構中同時具有磺酸基團和氨基，故其水溶液具有與蛋白質膠體類似的兩性性質。氨基芳磺酸染料分子的帶電情況會影響其在蠶絲絲素蛋白上的吸附，進而影響化學修飾反應的發(fā)生。因此，本文分別采取蛋白質沉淀法和ZetaPALS電位儀法對氨基芳磺酸染料在溶液中的帶電情況進行測定，兩種方法所得結果相互佐證。

1.2.2.1蛋白質沉淀法

蛋白質沉淀法的測定原理是兩性物質在等電點時的溶解度最小[8]。由下式朗伯比爾定律可知稀溶液的濃度c與吸光度A成正比關系，故分析不同pH值條件下的紫外吸光度即可分析其溶液狀態(tài)。

式中：A為吸光度；ε為摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）；c為吸光物質的濃度，mol/L；b為吸收層厚度，cm。

測定過程如下：首先將氨基芳磺酸染料利用蒸餾水配制成5g/L的溶液，取7個燒杯貼好標簽放置，并于每個燒杯中倒入100mL已配置好的溶液。然后利用pH計和稀鹽酸溶液調pH值，靜置兩天后離心，取上層清液，測試紫外吸光度。

1.2.2.2電位儀測試

基于相位分析光散射原理，應用ZetaPALS電位儀精確測定氨基芳磺酸染料在溶液中的電位，進而分析其分子帶電情況。

1.2.3蠶絲絲素蛋白修飾實驗

修飾條件：氨基芳磺酸染料2%，甲醛10g/L，蠶絲︰染料︰甲醛為1︰1︰30（摩爾比），溫度30℃，浴比1︰50，時間10h，修飾結束后將織物用去離子水洗凈、晾干。

皂洗條件：皂片5g/L，浴比為1︰50，溫度為60℃，時間為30min，皂洗后，將織物用去離子水沖洗干凈、晾干。

1.2.4織物表觀色深測試

采用美國SF600-PLUS測色配色儀測試織物的K/S值，D65光源，10°視場，每塊織物測試5次，取其平均值。

2結果與分析

2.1蠶絲的電荷特性分析

蠶絲纖維屬于兩性纖維，在一定pH值的水溶液中，分子可以呈現(xiàn)酸性基（—COO-）或堿性基（—NH+3），并具有酸堿平衡的等電點，其Zeta電位隨溶液pH值的變化而變化。當溶液的pH值在等電點以上時，羧基電離的數(shù)量大于氨基，纖維表面帶負電荷。在等電點以下時，情況正好相反。等電點時纖維呈電中性，Zeta電位值為零[7-9]。測定結果如圖3所示。

由圖3可知，未處理的蠶絲絲素蛋白的等電點為4.2。當電解質溶液的pH值在4.2以下時，Zeta電位為正值，蠶絲表面帶正電。當電解質溶液的pH值在4.2以上時，Zeta電位為負值，蠶絲表面帶負電。當pH值在5～8時，溶液由弱酸性到中性過渡，纖維表面的電位值基本不變。當pH值在8～10時，溶液呈堿性，蠶絲絲素蛋白中的肽鍵發(fā)生水解，使得纖維中的羧酸根離子數(shù)量增加，所以蠶絲表面的負電性增強。

甲醛處理后，蠶絲絲素蛋白的等電點變?yōu)?，較未處理前的等電點略有降低。分析認為是甲醛和蠶絲絲素蛋白中的氨基生成不帶電的西夫堿（—N=CH2）[10]，使得蠶絲上的氨基數(shù)量減少，從而導致甲醛處理后蠶絲纖維的等電點降低。

2.2氨基芳磺酸染料的電荷特性分析

本文利用ZetaPALS電位儀對氨基芳磺酸染料溶液進行了測定，結果如圖4所示。

溶液的電位與染料分子帶電情況直接相關，電位為負值說明染料帶負電荷，反之則帶正電荷。電位絕對值越大，說明染料分子所帶電荷數(shù)量越多。由圖4可知，當pH值為1時，氨基芳磺酸染料的電位接近0，說明染料分子帶電量近乎為0，此時的pH值為氨基芳磺酸染料的等電點；當pH值在1～2時，溶液電位呈負值且絕對值較小，說明染料分子中僅帶有少量的負電荷，分子間斥力較小，易相互聚集產生沉淀。當pH值在2～7時，隨pH值降低溶液的電位緩慢降低，當pH值高于7時電位降低速度提升。

因儀器量程限制，ZetaPALS電位儀測試pH值范圍為1～10。為進一步驗證實驗結果，通過調節(jié)溶液pH值，使染料溶液發(fā)生沉淀，從而進行電荷特性的測試分析，結果如圖5所示。

由圖5可知，當溶液pH值在1～2.2時，溶液離心處理后上清液的紫外吸光度值最低，接近于0，說明染料C.I.酸性棕4分子間無電荷斥力或斥力較小，分子間作用力（氫鍵力和范德華力）造成染料分子易相互聚集生成沉淀，此結果與ZetaPALS電位儀測試結果相符（等電點為1）。具體電荷變化情況如圖6所示。

2.3醛組分對氨基芳磺酸染料修飾蠶絲的作用

由于醛組分在Mannich反應中起到關鍵的橋接作用，其主要通過化學作用將芳伯胺化合物及蠶絲蛋白結合。但氨基芳磺酸染料對蠶絲絲素蛋白的化學修飾效果是電荷效應與醛的化學作用的綜合體現(xiàn)，因此本文對兩者的關系對整體修飾效果的影響進行了探討。圖7所示為選用氨基芳磺酸染料C.I.酸性棕4為顯色劑，分別在有醛和無醛條件下處理蠶絲織物（蠶絲蛋白︰染料︰甲醛為1︰1︰30的摩爾比），并用織物的皂洗后的K/S值來反映修飾效率。

由圖7可知，無醛條件下電荷效應對氨基芳磺酸染料在蠶絲蛋白上的吸附有顯著影響。由皂洗前曲線可知當pH值在1～3時，K/S值呈現(xiàn)上升趨勢，pH值為3時，K/S值最高；當34時，氨基芳磺酸染料與蠶絲纖維表面均帶負電荷，且負電量隨pH值的增大而增大，即靜電斥力作用逐漸增強，不利于染料吸附，因此K/S值下降。對比圖7無醛皂洗前后數(shù)據(jù)可知，蠶絲織物在皂洗后K/S值與皂洗前差別較大，這是由于無醛條件下，氨基芳磺酸染料與蠶絲絲素蛋白主要通過范德華力、氫鍵、離子鍵（pH1～4）相結合，缺乏化學鍵合作用導致皂洗后大部分染料易從蠶絲織物上洗除，因此皂洗后蠶絲織物K/S值較低。

加入甲醛后，皂洗后布樣的K/S值明顯高于未加甲醛的布樣，說明甲醛使得蠶絲蛋白和氨基芳磺酸染料形成了共價鍵結合，同時蠶絲蛋白著色的最佳pH值變?yōu)?（無醛條件的最佳pH值條件為3）。這是由于醛的加入使得氨基芳磺酸染料和蠶絲蛋白之間形成了化學結合，并且pH值為4（弱酸性條件）更有利于Mannich修飾反應的發(fā)生，因此該條件下修飾效率最高。

2.4元明粉對氨基芳磺酸染料修飾蠶絲的影響

由圖8皂洗前數(shù)據(jù)可知，當元明粉質量濃度為10g/L，pH值在1～4時，氨基芳磺酸染料Mannich法修飾蠶絲過程中不添加元明粉的修飾效果（K/S值）要比添加元明粉的修飾效果好；而當pH值在4～10時，元明粉的加入有助于提升修飾效果。由皂洗后數(shù)據(jù)可知，添加元明粉和不加元明粉的修飾效果（K/S值）變化趨勢基本相同。

當pH值在1～4時，蠶絲絲素蛋白與氨基芳磺酸染料帶相反電荷，此條件下添加元明粉會降低蠶絲絲素蛋白表面的帶電量，從而削弱電荷間引力起到緩染作用，最終導致K/S值降低。當pH值在5～10時，蠶絲絲素蛋白與氨基芳磺酸染料均帶負電荷，此條件下添加元明粉會降低蠶絲絲素蛋白表面及氨基芳磺酸染料的電負性，從而減弱斥力作用起到促染作用，增加K/S值[11-12]。由皂洗后數(shù)據(jù)可知，最終的化學修飾效率并未受到元明粉的影響，說明元明粉主要影響氨基芳磺酸染料與蠶絲蛋白之間的物理吸附作用，而對化學結合的影響很小。

3結論

本文通過固體表面Zeta電位儀、Zeta PALS電位儀、蛋白質沉淀法探究蠶絲纖維表面和氨基芳磺酸染料的帶電情況，研究表明：蠶絲絲素蛋白的等電點為4.2，氨基芳磺酸染料C.I.酸性棕4的等電點為1。當氨基芳磺酸染料在pH 1～2.2時溶解度較小，容易聚集生成沉淀。

無醛條件下，當pH值為3時脫膠蠶絲織物表面顯正電性，氨基芳磺酸染料顯負電性，且?guī)щ娏孔疃?，物理吸附效果較好（K/S值較高）。有醛條件下，醛的加入使得氨基芳磺酸染料和蠶絲蛋白之間形成了化學結合，且pH值為4時為Mannich反應提供弱酸條件，使得化學結合作用最強，反應修飾效率最高。當溶液pH≤4時，添加元明粉，削弱蠶絲表面與氨基芳磺酸染料之間電荷引力呈現(xiàn)緩染作用；當pH≥5時，添加元明粉，降低蠶絲表面及氨基芳磺酸染料的電荷斥力呈現(xiàn)促染作用。

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