張海濤 伍俊 汪宗桂

摘? 要：生物化學(xué)教學(xué)中關(guān)于蛋白質(zhì)組成的氨基酸種類和分類及其理化性質(zhì)是本科教學(xué)重要內(nèi)容，目前生物化學(xué)教材中有關(guān)氨基酸的闡述存在錯(cuò)誤或不足，該文根據(jù)文獻(xiàn)資料補(bǔ)充和更新一些新知識(shí)，提出一些修正意見和補(bǔ)充說(shuō)明，并解釋具有三個(gè)解離基團(tuán)氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectric point， pI）計(jì)算的方法和原理。

關(guān)鍵詞：氨基酸；本科教學(xué)；水溶性；等電點(diǎn)；生物化學(xué)

Abstract： In biochemistry teaching， the amino acid species and classification of protein composition and its physical and chemical properties are important contents of undergraduate teaching. At present， there are some errors or deficiencies in the description of amino acids in biochemistry textbooks. This paper supplements and updates some new knowledge according to the literature， puts forward some correction suggestions and supplementary explanations， and explains the method and principle of calculating isoelectric point （pI） of amino acids with three dissociating groups.

Keywords： amino acid; undergraduate teaching; water solubility; isoelectric point; biochemistry

生物化學(xué)與分子生物學(xué)是發(fā)展和更新較快的前沿學(xué)科之一，其主要任務(wù)是在分子水平上研究和闡述生物大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，物質(zhì)代謝途徑、規(guī)律及調(diào)節(jié)機(jī)制，遺傳信息的傳遞與表達(dá)，細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等，是高等醫(yī)學(xué)院校醫(yī)學(xué)專業(yè)及相關(guān)專業(yè)學(xué)生的必修課，并為學(xué)習(xí)其他基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)課程、在分子水平上認(rèn)識(shí)病因和發(fā)病機(jī)理、診斷和防治疾病奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。教材中的每一個(gè)概念都十分嚴(yán)謹(jǐn)，也十分重要，其嚴(yán)謹(jǐn)性不僅影響到這門學(xué)科的科學(xué)性，甚至?xí)绊懙秸麄€(gè)生命科學(xué)的科學(xué)性。對(duì)于那些比較權(quán)威及應(yīng)用比較廣泛的統(tǒng)編教材，在生命科學(xué)領(lǐng)域更是地位顯著，其影響也更加深遠(yuǎn)[1]。生物化學(xué)教學(xué)中關(guān)于蛋白質(zhì)組成的氨基酸種類和分類及其理化性質(zhì)是本科教學(xué)重要內(nèi)容，但現(xiàn)行的生物化學(xué)教材對(duì)上述內(nèi)容的闡述尚存在一些不足和遺漏，并且存在一些錯(cuò)誤的解釋。我們根據(jù)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)和匯總各方客觀資料，提出一些修正意見和補(bǔ)充說(shuō)明，以供從事生物化學(xué)教學(xué)的同行分析和商榷，從而保證生物化學(xué)教學(xué)的科學(xué)性和完整性。

一? 細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的氨基酸種類

現(xiàn)行的生物化學(xué)教材大多介紹組成蛋白質(zhì)氨基酸種類是20種，其實(shí)20世紀(jì)80年代[2]和21世紀(jì)初[3]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)實(shí)際有22種氨基酸由遺傳密碼對(duì)應(yīng)編碼，但大多數(shù)教科書一直沒有更新這方面的知識(shí)。目前已經(jīng)確定核糖體中合成的多肽（蛋白質(zhì)）可由22種氨基酸組成，其中20種氨基酸是與61種遺傳密碼對(duì)應(yīng)的基本氨基酸，而硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec，單字母縮寫 U）（或稱硒氨酸）[2]和吡咯賴氨酸（pyrrolysine，Pyl，單字母縮寫O）[3]是尚未列入教材的兩種參與細(xì)胞內(nèi)一些重要蛋白質(zhì)合成的氨基酸。硒氨酸和吡咯賴氨酸與在多肽鏈水平上修飾的氨基酸（如羥賴氨酸、羥脯氨酸）是不一樣的，硒氨酸和吡咯賴氨酸均有相應(yīng)的遺傳密碼對(duì)應(yīng)編碼，羥賴氨酸和羥脯氨酸是賴氨酸和脯氨酸羥化修飾后的產(chǎn)物，并不是直接通過(guò)密碼子翻譯而來(lái)。兩種氨基酸的發(fā)現(xiàn)，以及其對(duì)應(yīng)遺傳密碼的閱讀方式均與20種基本氨基酸有很大的不同，這提示生命的進(jìn)化及遺傳密碼的閱讀可塑性比我們想象的要復(fù)雜得多。建議新編教材補(bǔ)充列入這些新知識(shí)。

硒氨酸的結(jié)構(gòu)和半胱氨酸或絲氨酸類似，這三種氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的氧、硫、硒為同族元素（圖1）。硒氨酸的側(cè)鏈含有-SeH，該基團(tuán)的pKR=5.73， 在生理?xiàng)l件下，硒氨酸中的硒離子化，可作為一種極其有效的生物催化劑。

硒氨酸對(duì)應(yīng)的密碼子是UGA，這個(gè)密碼子原本是作為終止密碼子使用，但在一些特殊的mRNA序列中UGA編碼硒氨酸。mRNA上終止密碼子UGA后存在一個(gè)特殊的信號(hào)序列（SECIS），該序列具有引導(dǎo)把UGA解碼為Sec的功能。在真核生物的31個(gè)硒蛋白基因的3′非翻譯區(qū)均發(fā)現(xiàn)1或2個(gè)可能的SECIS結(jié)構(gòu)，大約60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA元件，它們都含有3段保守堿基AUGA-A（G/U）AA-GA[4]。

目前細(xì)胞內(nèi)沒發(fā)現(xiàn)存在游離的硒氨酸，也不存在硒氨酰tRNA合成酶，因此細(xì)胞內(nèi)無(wú)法直接將游離硒氨酸連接到tRNASec。在細(xì)胞內(nèi)， tRNASec在特殊的絲氨酰-tRNASec合成酶催化下，先與細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸（Ser）合成Ser-tRNASec，然后再將Ser-tRNASec攜帶的Ser修飾為Sec[4]。硒元素由硒代磷酸鹽提供。

真核細(xì)胞和細(xì)菌催化Ser-tRNASec轉(zhuǎn)變?yōu)镾ec-tRNASec的方式不同。在真核細(xì)胞內(nèi)，首先由磷酸絲氨酰-tRNASec激酶（O-phosphoseryl-tRNASec kinase，PSTK）催化Ser-tRNASec生成磷酸絲氨酰-Ser-tRNASec（Sep-tRNASec）。Sep-tRNASec在Sep-tRNASec：Sec-tRNASec合酶（Sep-tRNASec：Sec-tRNASec synthase，SepSecS）的催化下，接受磷酸硒的硒元素生成終產(chǎn)物Sec-tRNASec（圖2）[5]。磷酸硒是人體內(nèi)主要的硒供體，由磷酸硒合成酶2（selenophosphate synthetase2，SPS2） 利用硒蛋白/硒氨酸降解、硒化物和三磷酸腺苷（ATP）為反應(yīng)底物催化產(chǎn)生。最后，Sec-tRNASec通過(guò)一個(gè)專門的延伸因子EFsec轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體。在脊椎動(dòng)物中，SECIS結(jié)合蛋白2（SECIS-binding protein 2，SBP2）是解碼硒氨酸UGA密碼子所必需的輔助蛋白因子。

在細(xì)菌中，硒氨酸合成酶直接催化Ser-tRNASec去除絲氨?；鶊F(tuán)中的羥基形成中間體[6]。隨后，中間體接受磷酸硒鹽的硒元素最終產(chǎn)生Ser-tRNASec。

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)硒氨酸是細(xì)胞內(nèi)25種重要的含硒酶（尤其是抗氧化酶）活性中心，如谷胱甘肽過(guò)氧化酶、硫氧還蛋白還原酶、甲狀腺素-5′-脫碘酶、甘氨酸還原酶、甲酸脫氫酶等，含硒半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)一般稱為硒蛋白。硒氨酸在體外表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，而且從硒氨酸參與合成細(xì)胞內(nèi)硒蛋白的機(jī)制分析[5]，服用硒氨酸可能對(duì)合成硒蛋白無(wú)直接促進(jìn)作用，適當(dāng)?shù)鼐S持細(xì)胞內(nèi)硒元素的平衡才有助于硒蛋白合成。

吡咯賴氨酸（N6-[（2R，3R）-3-甲基-3，4-二氫-2-氫吡咯-2-甲酰]-L-賴氨酸）是賴氨酸的側(cè)鏈氨基被（4R，5R）4-吡咯啉-5-羧基酰胺化。2002年，Krzycki的研究小組在產(chǎn)甲烷菌的古細(xì)菌-巴氏甲烷八疊球菌的甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶中發(fā)現(xiàn)吡咯賴氨酸[7]，人體蛋白暫時(shí)沒發(fā)現(xiàn)有吡咯賴氨酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。

從吡咯賴氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分析（圖3），Pyl的側(cè)鏈含有酰胺鍵，吡咯環(huán)中的=N-也可與水相互作用，形成=N-H+，也就意味Pyl的側(cè)鏈的性質(zhì)是極性，且可能在pH7時(shí)帶正電荷。

吡咯賴氨酸由終止密碼子UAG有義編碼形成，由相應(yīng)的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶催化生成吡咯賴氨?；?tRNA（Pyl-tRNAPyl）。Pyl-tRNAPyl在核糖體中解讀mRNA上的UAG密碼子，將吡咯賴氨酸寫入合成的多肽鏈。Pyl-tRNAPyl的合成方式有兩種：吡咯賴氨酰-tRNA合成酶直接催化Pyl和tRNAPyl合成Pyl-tRNAPyl；先催化賴氨酸與tRNAPyl合成Lys-tRNAPyl，然后將Lys修飾成Pyl。細(xì)胞將mRNA終止密碼子UAG解讀成Pyl密碼子同樣依賴于UAG后存在一個(gè)特殊的核酸信號(hào)序列。

二? 氨基酸分類和側(cè)鏈與水溶性的關(guān)系

生物化學(xué)教材一般根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同，可將主要的20種氨基酸分成4類：非極性疏水性氨基酸、極性中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸[8-10]。

許多教材都有“非極性疏水性氨基酸的水溶性低”“極性中性氨基酸較非極性疏水性氨基酸的水溶性大”的總結(jié)性闡述[8-10]，但這是一個(gè)不科學(xué)的闡述，甚至可以說(shuō)是因氨基酸分類名稱而產(chǎn)生的一種錯(cuò)誤描述。從20種氨基酸所測(cè)得的實(shí)際理化參數(shù)來(lái)看，極性側(cè)鏈的氨基酸的水溶性不比非極性疏水性氨基酸水溶性大。表1是20種基本氨基酸的水溶性，從表中可知非極性疏水性氨基酸中的脯氨酸水溶性最大，而極性中性氨基酸的酪氨酸的水溶性最小。另外，兩個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)菢O性的酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）水溶性也不高?？梢?，氨基酸的水溶性與其側(cè)鏈名稱無(wú)直接聯(lián)系，但是氨基酸在組成蛋白質(zhì)后，非極性疏水性氨基酸的非極性側(cè)鏈可促進(jìn)蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域形成，使得蛋白質(zhì)在水中的溶解度變小，而極性中性氨基酸由于含有具有一定極性的R基團(tuán)，其極性側(cè)鏈常常參與組成蛋白質(zhì)親水區(qū)域形成，增加蛋白質(zhì)水溶性。

此外，對(duì)于一些氨基酸的分屬歸類也存在著值得商榷的地方。如，甘氨酸是唯一不含手性碳的氨基酸，側(cè)鏈只有一個(gè)氫原子，而C-H是極性鍵，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)其不應(yīng)該歸類在非極性疏水性氨基酸，實(shí)際上該氨基酸水溶性屬于易溶，建議單列該氨基酸為非手性碳氨基酸。

對(duì)于甲硫氨酸是屬于非極性疏水性氨基酸，還是屬于極性中性氨基酸，以往不同的教材有差異。鑒于甲硫氨酸的側(cè)鏈含有碳硫共價(jià)鍵，理論上甲硫氨酸屬于極性中性氨基酸，但由于甲硫氨酸的兩個(gè)碳硫共價(jià)鍵屬于雙鍵性質(zhì)，并且對(duì)稱直線分布，屬于典型的極性鍵非極性側(cè)鏈性質(zhì)，因此目前將甲硫氨酸歸在非極性疏水性氨基酸更合理些。

硒氨酸的側(cè)鏈含有C-Se鍵，屬于極性鍵，又由于該基團(tuán)的pKR=5.73， 在生理?xiàng)l件下，可釋放質(zhì)子，導(dǎo)致硒離子化，因此硒氨酸理論上歸于酸性氨基酸。半胱氨酸側(cè)鏈含-SH，-SH的pKR=8.18，在生理?xiàng)l件下，-SH理論上會(huì)部分解離，實(shí)際上半胱氨酸水溶液呈酸性，pH在3%時(shí)為1.2，1%時(shí)為1.7，0.1%時(shí)為2.4。因此半胱氨酸歸于弱酸性氨基酸似乎更合理些。絲氨酸側(cè)鏈含-OH，pKR=13.6，在生理?xiàng)l件下，-OH解離程度不高，故歸于極性中性氨基酸。

吡咯賴氨酸的歸屬側(cè)鏈的性質(zhì)是極性，且可能在pH7時(shí)帶正電荷，理論上歸于堿性氨基酸。

三? 氨基酸等電點(diǎn)計(jì)算

氨基酸的pI是由氨基酸分子內(nèi)的可解離基團(tuán)的解離常數(shù)負(fù)對(duì)數(shù)pKa決定的。甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸和非極性側(cè)鏈氨基酸的R側(cè)鏈無(wú)可解離基團(tuán)，因此這些氨基酸的pI由α-COOH和α-NH3+的解離常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)pK1和pK2決定的。pI的計(jì)算方法為：pI=1/2（pK1+pK2）。如亮氨酸的pK-COOH=2.36，pK-NH2=9.60，故pI=1/2（2.36+9.60）=5.98。

如果一個(gè)氨基酸中有三個(gè)可解離基團(tuán)，其等電點(diǎn)由α-COOH、α-NH3+和R基團(tuán)的解離狀態(tài)共同確定，按照溶液pH從低到高增加，各解離基團(tuán)釋放質(zhì)子的次序，選擇使得氨基酸分子處于凈電荷為零的兩個(gè)相鄰的pKa的平均值。例如谷氨酸的三個(gè)解離基團(tuán)：α-COOH（pK1=2.19）、γ-COOH（pKR=4.25）和α-NH3+（pK2=9.67）。該氨基酸分子可解離基團(tuán)釋放質(zhì)子的次序是α-COOH、γ-COOH和α-NH3+。當(dāng)pK1pK2時(shí)，α-羧基、γ-羧基以-COO-形式存在，而α-氨基以-NH2形式存在，此時(shí)氨基酸分子凈電荷為-2。因此酸性氨基酸pI=1/2（pK1+pKR）計(jì)算得出，同理推出堿性氨基酸pI=1/2（pK2+pKR）。

半胱氨酸也含三個(gè)解離基團(tuán)：α-羧基（pK1=1.96）、-SH（pKR=8.18）和α-氨基（pK2=10.28）。pKRpK2，α-NH3+解離后才能解離，所以按pI=1/2（pK1+pK2）計(jì)算（表2）。

總之，教材是學(xué)生學(xué)習(xí)專業(yè)知識(shí)的第一手參考資料，教材的編寫在保證科學(xué)性的基礎(chǔ)上，需要詳略得當(dāng)，及時(shí)更新知識(shí)[11]，并且在教材中一些容易混淆的知識(shí)點(diǎn)上教師與學(xué)生都會(huì)有更高的要求，一定要明晰，一些難點(diǎn)問題一定要解析透徹，這樣才能讓初學(xué)的學(xué)生更容易理解并掌握學(xué)習(xí)的知識(shí)。本文提供補(bǔ)充一些原生物化學(xué)教材有誤或不足的內(nèi)容，以供同行參考。

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