付 琳 劉 麗 楊 恒 王高富 任航行 周 鵬董賢文 張 麗,*

(1 重慶市畜牧科學(xué)院/重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，重慶 402460；2 重慶化工職業(yè)學(xué)院，重慶 401228; 3西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460)

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是大于200 nt的一種非編碼RNA。根據(jù)lncRNA與其靶基因在染色體上的位置關(guān)系，可以將lncRNA分為5個亞類：正義、反義、雙向、基因間和內(nèi)含子lncRNA[1]。研究顯示，lncRNA可以通過轉(zhuǎn)錄、后轉(zhuǎn)錄和翻譯水平在多種癌癥[2]、炎癥[3]、纖維化[4]、血管生成[5]的發(fā)展和進程中發(fā)揮正向或反向的調(diào)控作用。黑色素瘤是一種常見的皮膚惡性腫瘤，目前對黑色素相關(guān)lncRNA功能的研究，大多來源于黑色素瘤及其細胞系，在惡性黑色素瘤中，lncRNA可通過多種機制發(fā)揮作用，其可能通過調(diào)控相關(guān)信號分子誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、激活或抑制關(guān)鍵蛋白活性改變細胞外基質(zhì)性能、或激活PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、MAPK等信號通路活性，促進黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。

LncRNAXLOC_015132是與色素調(diào)控密切相關(guān)的重要lncRNAs，其在不同膚色山羊皮膚組織間存在顯著差異表達，與其同時被鑒定到的還有呈現(xiàn)高度組織特異性和功能特異性的LncRNAXLOC_15448、HOTAIR等[7]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAXLOC_15448可能通過XLOC_15448/miR-182-5p/MITF軸參與酉州烏羊皮膚黑色素細胞的生長及黑色素的沉積[8]，HOTAIR可能通過與HOXD10互作調(diào)控山羊皮膚黑色素細胞的分化與黑色素生成[9]。LncRNA可通過互作分子調(diào)控黑色素的沉積。Wei等[10]對黑色素瘤和皮膚痣的對比發(fā)現(xiàn)，UCA1能夠負調(diào)控抑癌基因miR-507，miR-507基因同時抑制叉頭盒M1(forkhead-boxM1，F(xiàn)OXM1)基因轉(zhuǎn)錄表達，推斷UCA1通過miR-507-FOXM1軸促進惡性黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Ding等[11]研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1海綿化miR-23a-3p能夠調(diào)節(jié)靶蛋白Krueppel樣因子3(krueppel-like factor 3，LF3)的表達；KLF3又被證明與多種腫瘤相關(guān)，推測NEAT1可能通過miR-23a-3p/KLF3 軸促進惡性黑色素瘤增殖、遷移和侵襲，表明lncRNA-miRNA-mRNA軸在黑色素瘤的增殖、生長和轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。但LncRNAXLOC_015132與色素沉積間的分子調(diào)控關(guān)系還鮮有報道。

酉州烏羊是迄今人們發(fā)現(xiàn)的唯一一種全身烏皮，眼、鼻、嘴、肛門、陰門等處可視黏膜也為烏色表型的山羊，是研究人類皮膚、黏膜黑變病的理想醫(yī)學(xué)模型[12]。本研究以酉州烏羊為試驗對象，酉州本地白山羊作為對照，研究LncRNAXLOC_015132基因在不同膚色上樣組織中的表達特性，并選取B16-F10小鼠黑色素瘤細胞作為細胞水平驗證對象，研究LncRNAXLOC_015132在黑色素瘤細胞增殖階段的表達情況，旨在通過對LncRNA XLOC_015132互作分子的預(yù)測，以及其靶基因功能的生物信息學(xué)分析，初步對LncRNA XLOC_015132調(diào)控黑色素沉積的功能探索提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇重慶市酉陽土家族苗族自治縣酉州烏羊國家級保種場中，飼養(yǎng)條件和日糧結(jié)構(gòu)一致，年齡相近(3～4周歲)、體重20～25 kg的酉州烏羊及本地白山羊各3只，采集心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、大腦、背黑線處皮膚、腿肌等組織。將采集后的組織統(tǒng)一編號，經(jīng)液氮處理后，于-80℃條件下長期保存。同時，因原代山羊黑色素瘤細胞未培養(yǎng)成功，本研究選取B16-F10小鼠黑色素瘤細胞作為細胞水平驗證對象，驗證LncRNAXLOC_015132在黑色素瘤細胞增殖階段的表達情況，B16-F10小鼠黑色素瘤細胞來源于重慶市山羊工程技術(shù)研究中心。黑色素瘤細胞增殖培養(yǎng)基使用RPMI1640培養(yǎng)基，購自北京gibco公司；胎牛血清購自新西蘭HyClone公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序得到LncRNA XLOC_015132序列，其全長為1 158 bp[7]。通過同源序列檢索，LncRNA XLOC_015132序列位于山羊基因組第25號染色體(NC_030832.1)rs3666465～rs3667620位置。搜索NCBI 中已經(jīng)公布的山羊和小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的相應(yīng)序列，使用軟件Prime 5.0設(shè)計引物(表1)，用于實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試驗。引物由上海生工合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 B16-F10黑色素細胞培養(yǎng)

將小鼠皮膚黑色素瘤細胞系B16-F10，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進行細胞復(fù)蘇，以T25細胞培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，觀察細胞的生長狀況并拍照，待細胞融合度達80%左右，使用0.25%胰酶消化后，離心收集細胞，以1.0×105個·mL-1的濃度鋪板于六孔板中，每個板3個重復(fù)，置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)基，觀察細胞生長狀況，于1、3、5和7 d各取一板細胞用于提取RNA。

1.4 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

利用RHAiso Plus(TaKaRa，大連)提取各個樣本總RNA，使用D2000r超微量分光光度計 (賽默飛世爾科技, 美國)檢測總RNA的濃度與純度，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。使用LnRcute LncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa，大連)， 將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并置于-20℃冰箱保存。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

按照SYBR Premix Ex Taq熒光定量檢測試劑盒(TaKaRa，大連)說明書，進行目的基因的qRT-PCR試驗。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板cDNA 2 μL(25 ng·μL-1)、2 × SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)、RNase ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸35 s，40個循環(huán)。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和 miRBase(http://www.mirbase.org/)查詢靶基因和miRNA序列以及l(fā)ncRNA靶miRNA預(yù)測。使用在線網(wǎng)站TargetScan 7.2 (http://bibiserv. techfak. unibielefeld. de/rnahybrid/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和miRBase用于miR-150-5p靶基因預(yù)測分析，取三者預(yù)測基因的交集，利用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)資源數(shù)據(jù)庫進行GO注釋分類和富集分析，利用KEGG Pathway進行基于信號通絡(luò)富集分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用2-△△Ct方法對qRT-PCR結(jié)果進行處理，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 22進行方差分析和顯著性t檢驗，組內(nèi)比較使用多重比較，不同小寫字母表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LncRNA XLOC_015132基因組織表達譜情況

以心臟組織為對照，對酉州烏羊和本地白山羊各組織進行LncRNAXLOC_015132基因的qRT-PCR試驗，結(jié)果顯示，LncRNAXLOC_015132在本地白山羊(圖1-A)和酉州烏羊(圖1-B)不同體組織中均有不同程度的表達。

注：A：本地白山羊； B：酉州烏羊。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A: Youzhou white goat. B: Youzhou dark goat. Different lowercase letters showed significant difference (P<0.05).The same as following.圖1 本地白山羊和酉州烏羊不同組織LncRNA XLOC_015132的相對表達量Fig.1 The relative expression of LncRNA XLOC_015132 mRNA in tissues of Youzhou white goat and Youzhou dark goat

LncRNAXLOC_015132基因在本地白山羊組織中的表達量由高到低依次為心臟、肌肉、肺、大腦、肝臟、皮膚、腎臟、脾臟組織。LncRNAXLOC_015132基因在心臟和肌肉中的表達量顯著高于其他組織，在肺中的表達量顯著高于脾臟、腎臟和皮膚組織，在大腦和肝臟組織中的表達量顯著高于脾臟組織，在脾臟、腎臟和皮膚組織中的表達量差異不顯著。

LncRNAXLOC_015132基因在酉州烏羊心臟中的表達量最高，其次為肺、肌肉、大腦、皮膚、腎臟、肝臟、脾臟組織。LncRNAXLOC_015132基因在心臟中的表達量顯著高于其他組織，在肺中的表達量顯著高于除肌肉外的其他組織，在肌肉、大腦、皮膚、腎臟中的表達量顯著高于脾臟組織，在腎臟、皮膚和肝臟組織中的表達量差異不顯著。

2.2 LncRNA XLOC_015132在成年酉州烏羊和本地白山羊相同組織的表達量比較

對LncRNAXLOC_015132基因在酉州烏羊和本地白山羊同一組織的表達情況進行比較，以本地白山羊各組織作為對照，結(jié)果如圖2所示。LncRNAXLOC_015132基因在酉州烏羊脾臟、肺、腎臟、大腦、皮膚組織中的表達量顯著高于本地白山羊，其余組織中的表達量差異不顯著，其中LncRNAXLOC_015132基因在酉州烏羊和本地白山羊皮膚中的表達量豐度差異最大。

注：內(nèi)參基因：山羊甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)。*表示與本地白山羊組織相比差異顯著(P<0.05)。Note: Reference gene: Glyceraldehyde-3-phosphate of goat(GAPDH). *indicate significant difference compared with Youzhou white goat at 0.05 lvel.圖2 本地白山羊和酉州烏羊同一組織LncRNA XLOC_015132的相對表達量Fig.2 The relative expression of LncRNA XLOC_015132 mRNA in the same tissue of Youzhou white goat and Youzhou dark goat

2.3 LncRNA XLOC_015132小鼠B16-F10黑色素細胞增殖階段的相對表達情況

應(yīng)用qRT-PCR檢測小鼠B16-F10黑色素細胞在增殖介質(zhì)中培養(yǎng)1、3、5和7 d時LncRNAXLOC_015132基因的表達，用小鼠GAPDH內(nèi)參基因的表達量進行校正。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNAXLOC_015132的表達量隨著B16-F10黑色素細胞培養(yǎng)時間的延長而逐漸增長(圖3)，暗示LncRNAXLOC_015132的遞增表達可能與B16-F10黑色素細胞的增殖相關(guān)。

注：內(nèi)參基因：小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)。Note: Reference gene: Glyceraldehyde-3-phosphate of mouse(GAPDH).圖3 LncRNA XLOC_015132在B16-F10細胞增殖階段的相對表達量Fig.3 Relative expression of LncRNA XLOC_015132 in the proliferation phase of B16-F10 cells

2.4 LncRNA XLOC_015132在黑色素瘤致病過程中互作分子的預(yù)測

2.4.1LncRNAXLOC_015132靶miRNA預(yù)測 運用miRBase在線軟件預(yù)測得到與LncRNAXLOC_015132結(jié)合的miRNA家族共16個，包括miR-6089、miR-4131-3p、miR-1587、miR2644、miR-3262、miR-3260-5p、miR-1285、miR-306/306-5p、miR-150/150-5p、miR319d/319h、miR-12301-5p、miR-12308b-3p、miR-1630、miR-2196、miR399a、miR3 627d，其中LncRNAXLOC_015132與多個物種的miR-150/150-5p有結(jié)合位點，如表2所示。

表2 LncRNA XLOC_015132靶miRNA統(tǒng)計Table 2 Statistics of target miRNA gene of LncRNA XLOC_015132

多篇文獻報道，miR-150-5p可作為黑色素瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[13-17]。結(jié)合2.2結(jié)果，將miR-150-5p作為LncRNAXLOC_015132的重要候選互作序列，進行LncRNA-miRNA-mRNA軸的預(yù)測分析，探究LncRNAXLOC_015132基因的調(diào)控作用。

2.4.2 miRNA預(yù)測靶基因預(yù)測和分析 利用miRBase在線數(shù)據(jù)庫查找miR-150-5p序列，對比發(fā)現(xiàn)人、小鼠、大鼠等物種的miR-150-5p成熟體序列“U U U G G C A A U G G U A G A A C U C A C A CU”在各物種之間高度保守。利用TargetScan 7.2、miRWalk和miRBase預(yù)測鼠miR-150-5p的潛在靶基因，選取靶基因的交集基因作為候選miRNAs的靶標(biāo)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種軟件共同存在的miR-150-5p的靶基因數(shù)為46個(圖4和表3)，這些基因被用于后續(xù)GO注釋條目和KEGG通路富集分析。

圖4 miR-150-5p靶基因交集預(yù)測Fig.4 The intersection prediction of miR-150-5p target genes

表3 mus-miR-150-5p的靶基因預(yù)測統(tǒng)計Table 3 Statistics of target gene of miR-182-5p

2.4.3 靶基因GO富集分析及代謝通路分析 對上述獲得的46個靶基因集合進行分子功能、生物學(xué)過程、細胞組成層面的注釋分類和富集分析，如圖5所示。靶標(biāo)基因GO富集顯示涉及大量的生物學(xué)調(diào)控過程，如對生物過程的調(diào)控、信號、定位、細胞增殖、免疫以及色素沉積等；分子功能主要富集在結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)等；細胞組成主要富集在細胞、細胞器、胞外區(qū)、膜等。

同時，對上述基因的KEGG信號通路富集分析和KEGG通路網(wǎng)絡(luò)分析(圖6、圖7)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量癌癥候選靶標(biāo)基因在Wnt、PI3K-AKT、Hippo、Hedgehog信號通路等顯著富集，如重組人細胞周期蛋白D2(G1/S-specific cyclin-D2,CCND2)(圖7)，在通路網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。

3 討論

近年來，lncRNAs因在致癌和癌癥進展中起到的重要作用而被廣泛關(guān)注，目前已在數(shù)百種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了lncRNAs的異常表達。皮膚作為人體重要屏障、分泌和免疫的最外層器官，其惡性黑色素瘤的發(fā)病率和病死率不斷上升[8]。近年來已發(fā)現(xiàn)多種黑色素候選lncRNA，如lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)[18]、H19[19]、黑素瘤高表達非編碼RNA(melanoma highly expressed non-coding RNA，MHENCR)[20]等都被報道在惡性黑色素瘤組織中表達增加或缺失，參與惡性黑色素瘤侵襲與轉(zhuǎn)移途徑。本研究中，LncRNAXLOC_015132在酉州烏羊和本地白山羊組織中廣泛表達，其在酉州烏羊皮膚組織的表達量顯著高于本地白山羊，此結(jié)果與Ren等[7]的研究一致。LncRNAXLOC_015132基因隨小鼠B16-F10黑色素細胞的培養(yǎng)時間延長而表達量逐漸增長，也暗示了LncRNAXLOC_015132可能參與黑色素瘤細胞的增殖。本研究中LncRNAXLOC_015132的表達模式還與山羊黑色素沉積候選lncRNA，如LncRNAXLOC_15448和LncRNAHOTAIR基因在酉州烏羊皮膚組織中的表達特征一致，LncRNAXLOC_15448通過參與黑色素細胞的增殖調(diào)控黑色素的沉積過程[8]，LncRNAHOTAIR基因通過調(diào)控黑色素細胞的分化參與黑色素的沉積[9]。因此，本研究推測LncRNAXLOC_015132可能通過正向調(diào)控黑色素細胞的增殖調(diào)控山羊皮膚黑色素的沉積過程。

圖5 miR-150-5p靶基因GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis results of miR-150-5p target genes

圖6 miR-150-5p靶基因KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG Pathway enrichment results of miR-150-5p target genes

注：玫瑰紅色圓圈代表信號通路，紫色圓圈代表靶基因，圓圈的大小代表通路靶基因的數(shù)量，Note: Rose red circle represent signal pathways, purple circle represen target genes, the size of the circle represent the number of genes in the pathway target圖7 mus-miR-150-5p靶基因KEGG通路網(wǎng)絡(luò)分析Fig.7 KEGG Pathway enrichment results of mus-miR-150-5p target genes

本研究中，miR-150-5p作為LncRNAXLOC_015132的靶標(biāo)分子，與黑色素瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、診斷息息相關(guān)。在黑色素瘤中，miR-150通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子成髓細胞癌基因(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)抑制黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[21]。miR-150-5p通過直接靶向黑色素瘤細胞中SIX1抑制細胞的增殖、遷移和侵襲[22]。miR-150-5p不僅是皮膚黑色素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，而且與腫瘤細胞存活的時間有關(guān)[23]。因此，miR-150-5p作為LncRNAXLOC_015132的靶標(biāo)分子可能參與抑制靶基因的表達或調(diào)控細胞存活時間進而影響黑色素的沉積。miR-150-5p靶基因的GO分析顯示，其主要在細胞、細胞器、胞外區(qū)發(fā)揮結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控等分子功能，參與生物調(diào)節(jié)、細胞增殖及色素沉積等生物學(xué)進程的調(diào)控。而CCND2作為本研究中miR-150-5p的靶基因，能夠被miR-182和轉(zhuǎn)錄因子NF-kB下調(diào)從而參與黑色素瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[24-25]。因此，LncRNAXLOC_015132的互作分子miR-150-5p可能通過抑制CCND2下調(diào)參與黑色素瘤細胞的增殖過程，調(diào)控皮膚黑色素的沉積。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs和miRNAs可以通過多種靶位參與腫瘤的發(fā)生過程，其作用方式如lncRNAs作為miRNA海綿/誘餌分子；lncRNAs和miRNAs相互促進；lncRNA和miRNA相互抑制；miRNA作為lncRNA的負調(diào)節(jié)劑等。如Liang等[26]發(fā)現(xiàn)lncRNA-ZFAS1對黑色素瘤有促腫瘤作用，并且ZFAS1/miR-150-5p/RAB9A軸能夠調(diào)控黑色素瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。LncRNA-MEG3通過調(diào)節(jié)miR-21/E-cadherin軸促進黑色素瘤的生長、轉(zhuǎn)移和形成[27]。結(jié)合本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果及前人研究報道，推測LncRNAXLOC_015132/miR-150-5p/CCND2軸可能在黑色素沉積過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但LncRNAXLOC_015132作用于miR-150-5p/CCND2的方式還需要進一步研究。

本研究KEGG富集分析顯示，LncRNAXLOC_015132/miR-150-5p的靶基因，如CCND2，在PI3K-AKT、Wnt等信號通路中起到關(guān)鍵樞紐作用。PI3K/AKT通路的異常激活與細胞增殖、存活、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤生長顯著相關(guān)[28]。Wnt通路的失調(diào)影響包括癌癥在內(nèi)的各種疾病發(fā)生[29]。前人研究發(fā)現(xiàn)，少數(shù)lncRNAs通過直接或間接的方式促進PI3K-AKT、Wnt信號通路活性來發(fā)揮其功能[30-31]。LncRNAFER1L4通過促進抑癌基因PTEN(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten)表達來抑制蛋白激酶B(protein Kinase B,AKT)活性[32]。LncRNABC087858通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1(Zinc-finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)和Snail(Zinc-finger transcriptional factor snail,Snail)參與PI3K/AKT信號通路和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[33]。miR-34a-5p與LncRNAC2dat1負相關(guān)，通過抑制沉默調(diào)節(jié)蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,Sirt1)使p38/ERK/AKT和Wnt信號通路失活[34]。LncRNAMEG3作為內(nèi)源性海綿分子與miR-127結(jié)合調(diào)控靶基因ZEB1，促使骨肉瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，其中miR-127和ZEB1都參與激活JNK和Wnt信號通路[35]。因此，LncRNAXLOC_015132的靶分子miR-150-5p也可能通過靶基因CCND2調(diào)控PI3K-AKT、Wnt等信號通路，促進黑色素瘤細胞增殖，但具體機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)LncRNAXLOC_015132在山羊各組織中廣泛表達，其在酉州烏羊皮膚中的表達顯著高于本地白山羊；在小鼠B16-F10黑色素瘤細胞中，LncRNAXLOC_015132的表達量隨著黑色素細胞的增殖呈遞增趨勢，結(jié)果顯示LncRNAXLOC_015132可能與黑色素沉積存在正相關(guān)關(guān)系。對LncRNAXLOC_015132靶標(biāo)分子的生物信息學(xué)分析顯示，LncRNA XLOC_015132/miR-150-5p/CCND2軸可能在黑色素沉積中發(fā)揮重要作用，其機制可能是LncRNAXLOC_015132通過miR-150-5p/CCND2激活PI3K-AKT、Wnt等信號通路，促進黑色素細胞的增殖，調(diào)控黑色素的沉積過程。