翁梓雨 李 雙 陳娟娟,*

(1寧波大學，農(nóng)產(chǎn)品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江 寧波 315211;2寧波海關技術中心，浙江 寧波 315040)

厚殼貽貝(mytiluscoruscus)隸屬于軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Lamellibranchia)，翼形亞綱(Pterimorphia)，貽貝目(Mussels)，貽貝科(Mytilidae)，自然分布于我國東海、黃海、渤海，具有營養(yǎng)和藥用價值高、生命力強、生長周期短、易養(yǎng)殖的特點，是我國重要的灘涂養(yǎng)殖貝類。貽貝養(yǎng)殖業(yè)的比重逐年增加，已成為我國沿海地區(qū)的幾大支柱性產(chǎn)業(yè)之一[1-2]。目前，關于厚殼貽貝的研究工作主要集中在養(yǎng)殖技術提升、基因克隆及相關免疫功能、蛋白組學及功能和稚貝發(fā)育抗逆性研究等方面[3-7]，但隨著水產(chǎn)行業(yè)的快速發(fā)展和人們生活水平的日益提高，國民對水產(chǎn)品品質及營養(yǎng)的要求也愈加嚴格，水產(chǎn)品中營養(yǎng)功效因子成為影響水產(chǎn)品價值的重要因素，而功效因子的開發(fā)應用可以進一步促進水產(chǎn)品的高值和高效利用。

類胡蘿卜素作為重要的營養(yǎng)功效因子成分，其種類組成與含量分布成為評價水產(chǎn)品品質的重要指標之一[8-9]，廣泛存在于水產(chǎn)生物體中[10-13]，具有組織著色[9，14]、提高環(huán)境適應能力[14-17]、參與自由基清除[17-18]、增強繁殖及提高機體免疫力[18]等功能。水產(chǎn)生物不能從頭合成類胡蘿卜素，但可根據(jù)自身需求通過外源攝食進行類胡蘿卜素的吸收與代謝，形成自身組織特異性類胡蘿卜素，從而發(fā)揮其功效[16, 19]。受到水產(chǎn)生物自身遺傳機制的調控和外源餌料差異的影響，不同水產(chǎn)品種類和組織部位的類胡蘿卜素吸收與代謝不同。目前，關于類胡蘿卜素在餌料微藻和水產(chǎn)生物之間的吸收與代謝研究甚少。

為了探究水產(chǎn)品中類胡蘿卜素吸收與代謝途徑，寧波大學貝藻種質資源與增養(yǎng)殖課題組前期通過單餌料投喂試驗，對成貝期的厚殼貽貝中類胡蘿卜素的組織分布情況進行研究，發(fā)現(xiàn)腸胰腺組織是類胡蘿卜素吸收與代謝的主要場所，且主要存在2條合成途徑——乙烯基到乙炔基類胡蘿卜素代謝途徑和4-酮基氧化途徑[20]。然而，關于厚殼貽貝幼蟲階段類胡蘿卜素吸收與代謝情況仍未見報道?；诖耍狙芯恳圆煌A段厚殼貽貝幼蟲(擔輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂期、眼點期和稚貝期)為研究對象，通過餌料投喂試驗，分析類胡蘿卜素組成和代謝相關基因的表達，探討?zhàn)D料中外源性類胡蘿卜素被厚殼貽貝幼蟲攝取后的吸收與代謝情況，以期為選擇性培育高品質的厚殼貽貝提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

類胡蘿卜素標準品(α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、β-隱黃質、玉米黃質、番茄紅素、蝦青素、葉黃質、紫玉米黃質、新黃質、巖藻黃素、硅甲藻黃素 )(純度>95%)、2,6-二叔丁基對甲酚(butylated hydroxytoluene，BHT)、乙酸銨和甲酸(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；類胡蘿卜素標準品(δ-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素、α-隱黃質、環(huán)氧玉米黃質、角黃素、硅藻黃素、巖藻黃酮醇)(純度>95%)，德國Dr. Ehrenstorfer公司。丙酮、甲醇和異丙醇(色譜純)，德國Merck公司；HiScript III RT SuperMix for qPCR和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，中國諾唯贊公司，1kb DNA Ladder和D2000 DNA Ladder，中國天根公司；0.22 μm聚四氟乙烯濾膜，北京迪馬公司；HLB固相萃取柱(150 mg/6 cc)，美國Waters公司；實驗用水為Milli-Q超純水(18.2 ΩM·cm-1)。

1.2 儀器與設備

UltiMate3000高壓液相色譜串聯(lián)Q-Exactive 四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀(配置H-ESI II源)，美國Thermo Fisher Scientific公司；Milli-Q高純水發(fā)生器，美國Millipore 公司；Delta 1-24 LSC plus冷凍干燥機、4-16KHS冷凍離心機，德國Sigma公司；Vortex08型漩渦振動器，德國Heldolph公司；ABI 7500 Real-time PCR儀，美國ABI Life technologies公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集和前處理 球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、叉鞭金藻(Dicrateriasp.)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、小硅藻(Nitzschiaclosteriumf.minutissima)、三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)、小球藻(Chlorellavulgaris)、青島大扁藻(Platymonashelgolandica)和微擬球藻(Nannochloropsissp.)均由寧波大學海洋生物實驗室藻種室提供。在2 500 mL錐形瓶中，于自然光條件下進行微藻培養(yǎng)，培養(yǎng)液采用f/2 配方，海水(pH 值8.30，鹽度28‰)在使用前經(jīng)過0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾后煮沸冷卻，培養(yǎng)溫度維持在20±2℃，每天搖晃3次，通過血球計數(shù)板測量藻種密度，并選取平臺期微藻作為研究對象，進行類胡蘿卜素組成和含量分析。此外，基于9種微藻的類胡蘿卜素種類和含量，最終選擇平臺期的叉鞭金藻和牟氏角毛藻轉移至50 L的塑料桶進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度維持在20±2℃，連續(xù)充入2%二氧化碳氣體以確保擴增速度，將處于指數(shù)生長期的叉鞭金藻和牟氏角毛藻投喂厚殼貽貝。

厚殼貽貝親貝采自浙江省舟山市嵊泗縣的枸杞島(30.71°N, 122.77°E)，產(chǎn)卵后，通過顯微鏡觀察，依次收集擔輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、眼點幼蟲和稚貝5個發(fā)育階段的幼貝樣品。其中，從發(fā)育成為D形幼蟲的第2天起對其進行投喂。投喂餌料為叉鞭金藻和牟氏角毛藻混合餌料微藻，2種餌料微藻的比例為1∶1(m∶m), 密度約為4×104cells·mL-1, 每日投喂2次，換水后投放1次。稚貝期幼蟲的投放餌料微藻密度約為10×104cells·mL-1。分別收集上述厚殼貽貝幼蟲并用2次砂濾海水暫養(yǎng)2 d，排空消化道中殘存的內容物，然后將幼蟲冷凍干燥至恒重。

稱取500 mg幼蟲或微藻樣品，加入10 mL甲醇溶液(含0.1% BHT)，震蕩5 min，超聲提取20 min，以 12 000 r· min-1高速離心5 min，得到有機層及殘渣。將有機相經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，甲醇(含0.1% BHT)作為洗脫液進行洗脫，洗脫液經(jīng)氮吹濃縮近干。剩余殘渣加入 10 mL甲醇-二氯甲烷溶液(1∶1, v∶v，含0.1% BHT)進行2次提取，震蕩5 min，超聲提取20 min，以12 000 r· min-1高速離心5 min，取上層有機相氮吹濃縮后準確加入2.0 mL甲醇溶液(含0.1% BHT)和1 g中性氧化鋁粉，充分震蕩，以12 000 r·min-1高速離心，得到上清液。合并上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待分析。

1.3.2 類胡蘿卜素的高效液相色譜-質譜條件[21]液相條件：固定相為Syncronis C18(2.1 mm × 150 mm, 1.7 μm)；流動相A：乙腈-水(9∶1, v∶v，含10 mmol·L-1乙酸銨)，流動相B：乙腈-異丙醇(7∶3, v∶v)。 采用梯度洗脫模式，0～5 min，5% B；5～25 min，5%～50% B；25～35 min，50%～100% B；35～45 min，保持100%B；45～45.1 min，100%～5% B；45.1～50 min，保持5% B。流速為0.3 mL·min-1，進樣量為5.0 μL。

質譜條件：在樣品運行前對儀器分別進行正、負離子校正。質譜在正、負離子轉換模式下進行全掃描測定，質量范圍為m/z 100～1 200(周期時長256 ms)，分辨率70 000(m/z 200)，自動增益控制(automatic gain control,AGC)目標值 5×e5， 負離子模式2 700 V，正離子模式3 800 V，離子傳輸管溫度300℃，鞘氣(N2)流速設置為35 L· h-1，輔助氣(N2)流速為10 L· h-1，氣化室溫度350℃，質譜采集時間為0.0～45.0 min，最大注入時長為200 ms。二級采用自動觸發(fā)模式(dd-MS2)， 分辨率為35 000 FWHM(m/z 200，周期時長128 ms)，自動增益控制(AGC)目標值2×e5，相對碰撞能量范圍10%～80%，保留時間(retention time, RT)窗口根據(jù)目標物設置為RT±1.0 min。

1.3.3 類胡蘿卜素的定性、定量分析 定性分析：利用高通量篩查軟件ExactfinderTM(Thermo Fisher Scientific)對類胡蘿卜素進行定性分析，要求精確質量誤差低于5×10-6。同時比對保留時間、分子量、同位素分布、主要二級碎片和二級質譜圖相識度，綜合判斷，以得到準確定性結果，避免假陽性結果。

定量分析：分別稱取適量類胡蘿卜素標準品，用丙酮(0.1% BHT)溶解，配制成 0.2 mg·mL-1的標準溶液，置于棕色瓶中，在-40℃條件下避光保存。配制10 μg·mL-1的類胡蘿卜素混合標準溶液，并逐級稀釋至濃度為10、20、50、100和200 ng·mL-1標準溶液。以濃度為橫坐標，標準品峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。貽貝黃素選擇蝦青素的標準曲線進行半定量分析。

1.3.4 類胡蘿卜素的RT-PCR分析 利用獲得的厚殼貽貝轉錄組內的部分序列數(shù)據(jù)，用4×gDNA wiper Mix和5 × HiScript Ⅲ RT SuperMix合成cDNA，并設計特異性引物(D5-驗證-FD5-驗證-R)在cDNA 上進行擴增，以驗證相關基因序列正確性。引物全稱和引物序列(5’→3’)見表1。利用TRIzol法對5個發(fā)育階段的厚殼貽貝幼蟲樣本(擔輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、眼點幼蟲和稚貝期)中的總RNA進行分離，并進一步合成單鏈cDNA(PrimeScript?RT regent Kit With gDNA Eraser，TaKaRa)。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (TaKaRa)在ABI 7500 Real-time PCR儀中進行實時熒光定量PCR分析，以18SrRNA作為內參。RT-PCR反應程序為：50℃ 2 min, 95℃ 5 min, 95℃ 10 s，共40個循環(huán)。然后60℃ 1 min, 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 95℃ 15 s，最后從60℃緩慢加熱到99℃。解離曲線分析用于確定目標的特異性。所有反應重復3次。通過2-ΔΔCT法進行相對基因定量分析。

表1 類胡蘿卜素相關基因表達的引物序列Table 1 Primer sequences used for carotenoid-related gene expression

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素定性方法建立

考慮到類胡蘿卜素分子結構中羥基、羰基等電負性基團的存在，選取正離子模式進行分析(表2)。葉黃質、玉米黃質和新黃質的結構與α、β-胡蘿卜素極其相似，僅在1, 3, 3-三甲基環(huán)己烯環(huán)取代位置不同，在質譜中產(chǎn)生分子離子峰[M]+；大部分含氧類胡蘿卜素更易形成準分子離子峰[M+H]+。21種類胡蘿卜素的選擇離子流圖，如圖1-A所示。

為了進一步深入解析類胡蘿卜素的結構，通過四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜，在分辨率高達70 000情況下，將21種類胡蘿卜素的分子離子峰分別在不同碰撞能量(20%、50%、 80%)進行二級質譜實驗，獲得高精度二級碎片離子(表2)，并通過元素模擬得到碎片離子的元素組成，進而探究游離類胡蘿卜素的裂解規(guī)律。結果表明，裂解過程主要集中在含氧基團附近。對于含氧的游離類胡蘿卜素，環(huán)上的羥基得到1個質子后形成[M+H]+，隨著碰撞能量的增加，環(huán)上的C-O鍵斷裂，失去一分子水形成[M+H-H2O]+；對于含雙羥基類胡蘿卜素，還存在連續(xù)丟失兩分子水后形成碎片離子[M+H-2H2O]+；不含氧的游離類胡蘿卜素不存在丟失水分子的碎片離子。由于分子結構中存在高度不飽和的共軛多烯基團，在高碰撞能下，會形成一系列的Δ=12 or 14的碎裂片段，質荷比分布在31～133 Da之間。另外，由于各個化合物之間末端環(huán)狀結構的差異，即取代基團的不同(羧基、羥基等)，形成的碎裂離子會有所差異，通過中性丟失環(huán)或含環(huán)結構的碎片離子，可進一步推測環(huán)狀結構組成。因此，根據(jù)標準品的保留時間、精確分子量和特征碎片離子，實現(xiàn)后續(xù)樣品中類胡蘿卜素的組成分析。經(jīng)微藻喂養(yǎng)后的厚殼貽貝幼蟲中發(fā)現(xiàn)響應較高的色譜峰，其保留時間為4.23 min(圖2)，準分子離子峰為m/z 598.401 6，將其進行二級碎裂，得到特征碎片離子m/z 197.117 1、m/z 127.112 1和m/z 109.101 3，與文獻報道貽貝黃素的分子量和結構一致[22]，因此推測該化合物為貽貝黃素(圖1-B)。

注：a：番茄紅素；b：鏈孢紅素；c：α-胡蘿卜素；d：β-胡蘿卜素；e：γ-胡蘿卜素；f：δ-胡蘿卜素；g：ε-胡蘿卜素；h：ζ-胡蘿卜素；i：α-隱黃質；j：β-隱黃質；k：玉米黃質；l：葉黃質；m：環(huán)氧玉米黃質；n：紫玉米黃質；o：新黃質；p：角黃素；q：硅藻黃 素；r：硅甲藻黃素；s：巖藻黃酮醇；t：巖藻黃素；u：蝦青素。Note: a: Lycopene. b: Neurosporene. c: α-Carotene. d: β-Carotene. e: γ-Carotene. f: δ-Carotene. g: ε-Carotene. h: ζ-Carotene. i: α-Cryptoxanthin. j: β-Cryptoxanthin. k: Zeaxanthin. l: Lutein. m: Antheraxanthin. n: Violaxanthin. o: Neoxanthin. p: Canthaxanthin. q: Diatoxanthin. r: Diadinoxanthin. s: Fucoxanthinol. t: Fucoxanthin. u: Astaxanthin.圖1 類胡蘿卜素選擇離子流圖(A)和貽貝黃素二級質譜圖(B)Fig.1 Selective ionization chromatogram of carotenoids (A) and MS/MS of mytiloxanthin (B)

2.2 不同餌料微藻中類胡蘿卜素含量

餌料微藻作為雙殼貝類主要的食物來源，其營養(yǎng)成分組成，尤其是類胡蘿卜素的種類和含量對雙殼貝類生長繁殖至關重要。比較分析金藻綱的湛江等鞭金藻、球等鞭金藻和叉鞭金藻，硅藻綱的牟氏角毛藻、小硅藻和三角褐指藻，綠藻綱的小球藻、青島大扁藻和微擬球藻9種餌料微藻的類胡蘿卜素組成，結果表明(表3)，類胡蘿卜素的種類和含量在不同餌料微藻間存在明顯差異。金藻的主要類胡蘿卜素為巖藻黃素、巖藻黃酮醇、β-隱黃質和β-胡蘿卜素，其中叉鞭金藻的總類胡蘿卜素含量最高，達到1 290.7 mg·kg-1，其次是湛江等鞭金藻(634.9 mg·kg-1)，球等鞭金藻的總類胡蘿卜素含量最低(424.1 mg·kg-1)。巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和β-胡蘿卜素是硅藻的主要類胡蘿卜素，其中牟氏角毛藻中的總類胡蘿卜素含量最高，為1 326.4 mg·kg-1，其次是小硅藻(635.1 mg·kg-1)，三角褐指藻最低(544.0 mg·kg-1)。綠藻的主要類胡蘿卜素為β-胡蘿卜素和葉黃質，其中小球藻的總類胡蘿卜素含量最高，達到94.1 mg·kg-1，其次是青島大扁藻(65.7 mg·kg-1)， 微擬球藻的含量最低(49.5 mg·kg-1)。 綜上所述，金藻綱和硅藻綱微藻的總類胡蘿卜素含量明顯高于綠藻綱微藻，其中叉鞭金藻(除葉黃質外)和牟氏角毛藻(除環(huán)氧玉米黃質外)在類胡蘿卜素種類與含量方面優(yōu)勢顯著。因此選取這兩種藻類作為厚殼貽貝人工投喂組餌料，分析微藻餌料的類胡蘿卜素組成對厚殼貽貝幼蟲體內類胡蘿卜素吸收和代謝的影響。

2.3 不同生長階段厚殼貽貝幼蟲中類胡蘿卜素分布與基因表達量

通過叉鞭金藻和牟氏角毛藻混合投喂試驗，對不同生長階段厚殼貽貝(幼蟲)中類胡蘿卜素的分布情況進行分析，結果表明(圖2)，幼蟲中共鑒定得到5種類胡蘿卜素：1種新合成類胡蘿卜素——貽貝黃素，4種微藻來源類胡蘿卜素——α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、巖藻黃酮醇、巖藻黃素。在厚殼貽貝的不同生長階段，對4種微藻來源類胡蘿卜素的富集能力有顯著差異。在擔輪幼蟲中未檢測到類胡蘿卜素，D形幼蟲開始持續(xù)性積累類胡蘿卜素，從D形幼蟲到殼頂期類胡蘿卜素的增長速度最快，而從殼頂期到稚貝期，類胡蘿卜素仍持續(xù)性增長。作為新合成的類胡蘿卜素，貽貝黃素的變化趨勢與其他4種微藻來源的類胡蘿卜素有所不同，貽貝黃素在殼頂期才開始被檢出(圖3)，含量達到1.53 mg·kg-1。當發(fā)育到稚貝期時，其含量增加了1.13倍?？傊?，幼蟲不同發(fā)育階段的總類胡蘿卜素整體呈現(xiàn)上升趨勢，含量范圍為1.68～26.12 mg·kg-1。

圖2 不同厚殼貽貝幼蟲發(fā)育階段中貽貝黃素色譜圖Fig.2 The chromatograms of mytiloxanthin in different larval stages of M.coruscus

注：不同字母表示厚殼貽貝幼蟲在不同生長階段間的差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P≥0.05)。下同。Note：Different letters mean significant differences (P<0.05) between the groups of different larval stages of M.coruscus and the same letters mean no significant differences(P≥0.05). The same as following.圖3 不同生長階段厚殼貽貝幼蟲的類胡蘿卜素組成Fig.3 The contents of carotenoids in different larval stages of M.coruscus

為深入了解類胡蘿卜素在不同生長階段分子機制的差異性，進一步分析了上述4個類胡蘿卜素相關基因在厚殼貽貝幼蟲階段(擔輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂期、眼點期和稚貝期)中的表達量情況。結果表明(圖4)，類胡蘿卜素合成相關的β-胡蘿卜素-15，15′-加雙氧酶βCDIOX基因在整個幼蟲階段均未表達，而參與類胡蘿卜素吸收、代謝的相關基因——磷酸腺苷盒式A1(ABCA1)、B類I型清道夫受體(SR-BI)和β-胡蘿卜素-15,15′-加單氧酶(βCMOOX)的表達水平隨幼蟲發(fā)育獲得持續(xù)性積累，在稚貝期，其表達量達到最高，是擔輪幼蟲的7.66～54.36倍；其中，從D形幼蟲到殼頂期的增長最為迅速，其表達量是擔輪幼蟲的5.61～38.69倍。異性分布可能與幼蟲階段消化系統(tǒng)逐漸完善，捕食更為積極相關：D形幼蟲的體內出現(xiàn)收縮肌及閉殼肌原基，促使其游動活躍，體內消化道逐漸發(fā)達，胃部擴張，已初步具備捕食餌料能力，開始持續(xù)性積累類胡蘿卜素；此外，殼頂期幼蟲的規(guī)格是D形幼蟲的3倍左右，捕食能力顯著增強。因此，從D形幼蟲到殼頂期，相關基因和類胡蘿卜素均呈顯著上升趨勢。其中，參與類胡蘿卜素合成代謝功能的βCMOOX基因表達量上升最為顯著，在殼頂期表達量是擔輪幼蟲階段的38.69倍，由此推測，該基因很可能參與了殼頂期新出現(xiàn)類胡蘿卜素——貽貝黃素的合成過程。

圖4 不同厚殼貽貝幼蟲發(fā)育階段中類胡蘿卜素相關基因表達量Fig.4 Expressions of carotenoid related genes in different larval stages of M.coruscus

3 討論

水產(chǎn)生物自身不能合成類胡蘿卜素，其來源僅靠食物攝入[23-24]。不同的食物來源造成水產(chǎn)生物中類胡蘿卜素吸收和代謝的差異[25]。因此為了深入研究厚殼貽貝幼蟲對類胡蘿卜素利用率，本研究通過餌料微藻投喂試驗，分析不同幼蟲階段對類胡蘿卜素的吸收和代謝差異。在9種餌料微藻中，叉鞭金藻和牟氏角毛藻中的類胡蘿卜素種類最多、含量最高，經(jīng)這2種餌料微藻喂養(yǎng)后，擔輪幼蟲并無類胡蘿卜素檢出，而從D形幼蟲到稚貝期，類胡蘿卜素含量逐漸增加，且在殼頂期時類胡蘿卜素累積速度最快，是擔輪幼蟲的20倍，這可能與D形幼蟲已具備捕食餌料能力，且殼頂期消化系統(tǒng)逐漸完善，捕食更為積極相關。此外，相比于D形幼蟲階段，稚貝期中吸收的主要類胡蘿卜素——巖藻黃素增加了30.1倍，這與巖藻黃素作為叉鞭金藻(33.80%)和牟氏角毛藻(54.24%)中主要類胡蘿卜素相關。由此表明，厚殼貽貝幼蟲體內攝入的類胡蘿卜素種類和含量與餌料微藻中呈現(xiàn)一定的正相關性。

厚殼貽貝幼蟲中鑒定到一種新合成類胡蘿卜素——貽貝黃素，在殼頂期最先被檢測到，而到了稚貝期，其含量增加了近1倍。據(jù)文獻報道，貽貝黃素的代謝過程可能與貝類的兩條類胡蘿卜素合成途徑相關，即乙烯基類胡蘿卜素到乙炔基類胡蘿卜素代謝途徑和4-酮基氧化途徑[20, 25]。如紫貽貝(Mytilusedulis)通過乙烯基到乙炔基類胡蘿卜素代謝途徑產(chǎn)生異黃素和貽貝黃素[25]，扇貝經(jīng)4-酮基氧化途徑可將硅藻黃素氧化為果膠酮和梳黃質[26-27]。因此，在厚殼貽貝幼蟲的殼頂期中發(fā)現(xiàn)的貽貝黃素可能也是通過乙烯基類胡蘿卜素到乙炔基類胡蘿卜素代謝途徑合成的，且貽貝黃素重要前體物質——巖藻黃素含量急劇升高，也證實了該合成途徑的存在。Li等[20]研究了厚殼貽貝的成貝以巖藻黃素和巖藻黃酮醇為前體化合物，經(jīng)乙烯基到乙炔基類胡蘿卜素代謝途徑，合成貽貝黃素和梳黃質，以及經(jīng)過4-酮基氧化途徑合成果膠酮、蝦青素、海膽酮和羥基海膽酮。但是這些類胡蘿卜素的代謝速率仍不明確。而厚殼貽貝幼蟲階段僅檢測到貽貝黃素，也證實了該化合物是厚殼貽貝吸收外源攝入的類胡蘿卜素后，最先代謝而成的一種類胡蘿卜素。

目前關于類胡蘿卜素關鍵性酶的調控通路研究尚不夠深入，部分研究發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素被動物攝食后，大致經(jīng)過3個過程：酶解過程、受體介導的胞吞過程和脂質選擇性運輸過程，參與的基因主要包括ABCA1、SR-BI、載脂蛋白(Apolipoprotein)、βCMOOX和βCDIOX等[28-31]。SR-BI和分化抗原簇36(CD36)為腸吸收類胡蘿卜素過程中的重要基因[28-29]，βCMOOX和βCDIOX是腸上皮細胞中類胡蘿卜素代謝關鍵酶，其中，βCMOOX催化β-胡蘿卜素斷裂生成 2分子的視黃醛，繼續(xù)代謝成視黃醇，βCDIOX催化β-胡蘿卜素生成長鏈β-阿樸胡蘿卜素醛和短鏈β-阿樸胡蘿卜素醛，然后進一步轉化為阿樸視黃酸[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝幼蟲中的ABCA1、SR-BI和βCMOOX從擔輪幼蟲階段開始表達，其中βCMOOX在殼頂期的表達量最大，分別是ABCA1和SR-BI的6.9和6.4倍，由此也進一步證明βCMOOX可能參與了吸收外源攝入的類胡蘿卜素進行貽貝黃素代謝合成。但貽貝黃素合成路線上的關鍵性酶、代謝通路的完整性仍需進一步研究。

4 結論

本研究建立了常見的21種類胡蘿卜素的高效液相色譜-質譜聯(lián)用分析方法，比較不同餌料微藻的類胡蘿卜素種類和含量，選擇叉鞭金藻和牟氏角毛藻作為厚殼貽貝幼蟲的最佳餌料。結果表明，擔輪幼蟲不具有吸收類胡蘿卜素能力，而從D形幼蟲起，厚殼貽貝幼蟲的類胡蘿卜素累積能力隨著發(fā)育進程的推進而逐漸增強，且?guī)r藻黃素是其主要的吸收色素。此外，在參與類胡蘿卜素合成代謝的βCMOOX作用下，貽貝黃素是厚殼貽貝幼蟲階段唯一體內合成的類胡蘿卜素。該結果可為進一步研究類胡蘿卜素在水產(chǎn)生物中的代謝途徑提供依據(jù)，且有助于為高品質厚殼貽貝培育工作提供技術支撐。