謝瑞瑩 曾露桂 姜超英 聶 瓊,,*

(1貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025； 2貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3貴州省煙草公司 貴州 貴陽 550081)

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，并對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄有激活或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白[1]。轉(zhuǎn)錄因子一般含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，前者可識(shí)別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因上游，后者可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域所調(diào)節(jié)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[2]。MYB轉(zhuǎn)錄因子(MYB transcription factor)家族被認(rèn)為是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物次生代謝、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、激素和環(huán)境因子的應(yīng)答等生物學(xué)過程[3]，在植物抗逆應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[4]。此外，MYB轉(zhuǎn)錄因子通常與其他蛋白相互作用形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體共同調(diào)控各種代謝、發(fā)育過程或抗逆反應(yīng)[5-6]。

酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因激活報(bào)告基因的表達(dá)，從而探測(cè)蛋白之間的相互作用[7]。該技術(shù)靈敏度高、功能強(qiáng)大、適用范圍廣，現(xiàn)已被應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域。在植物抗逆機(jī)制研究中，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從cDNA文庫中篩選到9類與四季秋海棠(Begoniasemperflorens)BsMYB62互作的蛋白、2個(gè)與木薯(ManihotesculentaCrantz)MeMYB2互作的蛋白，并推測(cè)BsMYB62與這9類蛋白相互作用響應(yīng)低溫和高光脅迫[8]，MeMYB2與MeNPH3互作參與光信號(hào)調(diào)節(jié)、與MePetB互作參與氣孔調(diào)節(jié)[9]。

煙草(Nicotianatabacum)是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是重要的模式作物。探討煙草轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)控機(jī)制，對(duì)培育煙草抗逆品種具有重要意義。本課題組前期克隆了NtMYB4a(MN178131)，該基因具有2個(gè)典型的MYB結(jié)構(gòu)域和35個(gè)磷酸化位點(diǎn)，屬于R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子亞家族，該基因參與煙草綠原酸、花青素的合成，對(duì)干旱、低溫和鹽脅迫等也有明顯的響應(yīng)[10]。而NtMYB4a參與調(diào)控這些次生代謝的合成或響應(yīng)抗逆反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍有待研究。因此，本研究擬構(gòu)建NtMYB4a基因酵母雙雜交誘餌載體，從煙草cDNA文庫中篩選其互作蛋白并驗(yàn)證，以期為進(jìn)一步研究NtMYB4a參與響應(yīng)非生物脅迫的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

試驗(yàn)材料為貴州大學(xué)煙草學(xué)院煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的自育煙草品系GDH88、煙草酵母雙雜交cDNA文庫、pGBKT7載體；AH109和DH5α感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)、質(zhì)粒提取試劑盒(DP112)、酵母質(zhì)粒提取試劑盒(DP103)、RNAprep pure Plant Kit總RNA提取試劑盒(DP432)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(KR118)、熒光定量試劑盒Talent qPCR PreMix(SYBR Green)(FP209)等購自天根生化科技(北京)有限公司；X-α-gal(10903ES71)、Axygen(AxyPrep DNA)凝膠回收試劑盒購自貴州明涵生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘餌載體pGBKT7-NtMYB4a的構(gòu)建 利用基因合成技術(shù)通過引物合成、PCR的方法將基因序列融合并克隆入pGBKT7載體進(jìn)行pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體的構(gòu)建。利用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)目的基因的引物(表1)。

表1 目的基因合成相關(guān)引物Table 1 Objective gene synthesis related primers

全長(zhǎng)第一輪PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA聚合酶(PV2)0.5 μL、5×PV2 Buffer 10 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、引物0.5 μL、ddH2O 38 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性25 s，62℃退火20 s，72℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min，4℃保存。

全長(zhǎng)第二輪PCR反應(yīng)體系(50 μL)：第一輪PCR產(chǎn)物0.3 μL，DNA聚合酶(PV2)0.5 μL、5×PV2 Buffer 10 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、引物1 0.5 μL、引物12 0.5 μL、ddH2O 37.2 μL。同上一步反應(yīng)程序。

膠回收第二輪PCR產(chǎn)物，流程參照Axygen凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。

用雙酶切pGBKT7質(zhì)粒的NdeI、BamHI酶切位點(diǎn)，并進(jìn)行膠回收，流程參照Axygen凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。

重組連接反應(yīng)體系：目的基因膠回收產(chǎn)物4 μL、pGBKT7質(zhì)粒3.5 μL、重組酶2.5 μL；置于50℃水浴25 min，放置2～3 min使溫度降低至室溫。

大腸桿菌的轉(zhuǎn)化：從-80℃超低溫冰箱取出DH5α感受態(tài)后，置于冰上融化，約15 min，待感受態(tài)融化后用移液槍吸取10 μL重組連接產(chǎn)物加入其中，冰浴15 min后42℃熱激90 s，立即進(jìn)行冰浴2 min，然后加入1 mL的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃、220 r·min-1溫浴搖床培養(yǎng)1 h，之后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB固體平板上(含卡那抗性)，再放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)。

從過夜培養(yǎng)后的平板上挑取單菌落于裝有1 mL LB液體培養(yǎng)基的無菌離心管中，培養(yǎng)8～12 h后用pGBKT7的通用引物(T7/3′BD)進(jìn)行菌液PCR，然后利用凝膠電泳鑒定陽性克隆，隨機(jī)挑選4個(gè)陽性菌用5 mL LB液體培養(yǎng)基于37℃、200 r·min-1的搖床進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。最后將測(cè)序得到的序列利用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，若顯示目的片段NtMYB4a成功插在正確的序列位置，則說明誘餌載體pGBKT7-NtMYB4a構(gòu)建成功。

1.2.2 pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體毒性和自激活性檢測(cè) 取3管100 μL AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，分別加入誘餌重組質(zhì)粒和獵物空載質(zhì)粒各5 μL，Carrier DNA 10 μL(95～100℃水浴5 min，重復(fù)1次)，PEG/LiAc 500 μL，并用移液槍輕柔的吸打混勻，30℃水浴30 min(中途后翻轉(zhuǎn)6～8次混勻)；將離心管置于42℃水浴15 min(中途翻轉(zhuǎn)6～8次混勻)，然后取出置于離心機(jī)5 000 r·min-1離心40 s，棄上清，用400 μL ddH2O重懸，5 000 r·min-1離心30 s后棄上清，最后用200 μL ddH2O重懸，之后涂布于DDO、DDO/X、TDO平板上觀察菌株生長(zhǎng)情況，由此判定誘餌的毒性和自激活檢測(cè)。若pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體有一定的本底表達(dá)，可通過使用3′AT抑制劑抑制其自激活性。

1.2.3 酵母雙雜交文庫篩選及陽性克隆的鑒定 將SD/-Trp平板上長(zhǎng)至直徑2～3 mm的重組誘餌載體轉(zhuǎn)化菌落接種于50 mL SD/-Trp的液體培養(yǎng)基中，在30℃、250 r·min-1的搖床中培養(yǎng)直至菌液OD600=0.8。將菌液1 000×g離心5 min后，去除上清，用5 mL SD/-Trp 液體培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，獲得誘餌菌液。將 1 mL cDNA文庫和5 mL誘餌菌液接種于45 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基，于30℃、50 r·min-1條件下培養(yǎng)20 h，鏡檢結(jié)合生長(zhǎng)子的產(chǎn)生。培養(yǎng)結(jié)束后將雜交菌液 1 000×g 離心10 min，去除上清，用10 mL 0.9% NaCl溶液重懸菌體。將菌液按每板200 μL涂布于150 mm TDO/X平板，倒置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。增大篩選壓力排除假陽性，將直徑大于2 mm的藍(lán)色菌落全部點(diǎn)種至QDO/A/X平板上培養(yǎng)，倒置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察互作情況。挑選藍(lán)斑克隆接種于3 mL QDO液體培養(yǎng)基，抽提酵母質(zhì)粒，操作方法參照天根酵母質(zhì)粒提取試劑盒(DP112)進(jìn)行，并送至上海生物工程有限公司測(cè)序。采用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.4 回轉(zhuǎn)酵母驗(yàn)證 以獵物質(zhì)粒載體PGADT7的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。將AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化，向30 μL酵母感受態(tài)中分別加入誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒各5 μL，Carrier DNA 10 μL(95～100℃水浴5 min，重復(fù)1次)和500 μL PEG/LiAc，并使用移液槍輕柔的吸打混勻，30℃水浴30 min(中途翻轉(zhuǎn)6～8次混勻)；將離心管置于42℃水浴15 min(中途翻轉(zhuǎn)6～8次混勻)，5 000 r·min-1離心40 s，去除上清，用400 μL ddH2O重懸，5 000 r·min-1離心30 s后棄上清，用200 μL ddH2O重懸，最后將重懸菌液涂布于SD/-Leu/-Trp平板，倒置平板于29℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。挑取長(zhǎng)至2～3 mm的白色菌體，放于2 mL SD/-Leu/-Trp的液體培養(yǎng)基中，29℃、200 r·min-1培養(yǎng)16～18 h，當(dāng)OD600達(dá)到0.2左右時(shí)，按1∶10∶100稀釋菌液，各取5 μL分別點(diǎn)種于SD/-Leu/-Trp、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X平板上，平板在超凈工作臺(tái)內(nèi)充分吹干后，將平板倒置于29℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察互作情況。

1.2.5 候選互作蛋白的表達(dá)分析 將長(zhǎng)勢(shì)一致的煙草幼苗在相對(duì)濕度65%～75%、溫度25℃、14 h光照/10 h 黑暗的人工智能氣候箱中培養(yǎng)，當(dāng)煙苗生長(zhǎng)至5葉時(shí)進(jìn)行4℃低溫處理，以25℃為對(duì)照，分別在處理0、6、12、24、36、48、72 h后取第2、第3片展開葉，迅速用液氮處理后放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?株混勻作為1個(gè)樣品，各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quautitative real-time PCR, qRT-PCR)。

樣品總RNA用RNAprep pure Plant Kit總RNA試劑盒提取，用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA；根據(jù)候選蛋白的cDNA序列，利用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)熒光引物(表2)，用熒光定量試劑盒Talent qPCR PreMix(SYBR Green)對(duì)候選蛋白進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)，步驟參照試劑盒說明書。

表 2 熒光定量PCR引物Table 2 Primer used for real-time PCR

qRT-PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Talentl qPCR PreMix 12.5 μL、正向引物(10 μmol·L-1)0.75 μL、反向引物(10 μmol·L-1)0.75 μL、cDNA模版2 μL、RNase-free ddH2O 9 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，55～94℃進(jìn)行溶解曲線分析。采用2-ΔΔCt法計(jì)算NtMYB4a及候選蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量。利用DPS7.5軟件完成差異顯著性分析，相關(guān)分析由R語言軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體pGBKT7-NtMYB4a的構(gòu)建

將合成的NtMYB4a連接到載體pGBKT7上，重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并對(duì)所得單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示，目的片段與基因片段(746 bp)大小一致。抽提大腸桿菌質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確，說明pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體構(gòu)建成功。

注：1～8：隨機(jī)挑選的8個(gè)克?。? 000bp DNA Ladder Marker.Note: 1～8:Randomly picked 8 clones. 5 000bp DNA Ladder Marker.圖1 陽性克隆菌液PCR電泳檢測(cè)Fig.1 PCR electrophoresis detection of positive clone solution

2.2 pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體自激活性及毒性檢測(cè)

將pGBKT7-NtMYB4a誘餌重組質(zhì)粒和獵物空載轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于DDO、DDO/X、TDO平板進(jìn)行毒性和自激活檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。酵母在DDO平板上能正常生長(zhǎng)，說明誘餌pGBKT7-NtMYB4a+pGADT7已成功轉(zhuǎn)入宿主菌中且對(duì)宿主菌無毒性；酵母在DDO/X平板能生長(zhǎng)且變藍(lán)，說明誘餌pGBKT7-NtMYB4a+pGADT7有自激活現(xiàn)象，能夠激活宿主菌報(bào)告基因MELl的表達(dá)，從而使X-α-gal變藍(lán)。酵母能在TDO平板生長(zhǎng)，說明誘餌pGBKT7-NtMYB4a+pGADT7有自激活現(xiàn)象，激活了HIS3報(bào)告基因。將pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體涂布于TDO/3′AT平板，酵母在5 mmol·L-1的TDO/3′AT平板上能夠生長(zhǎng)，說明5 mmol·L-13′AT不能抑制HIS3報(bào)告基因的背景表達(dá)；酵母在10 mmol·L-1的TDO/3′AT平板上不能生長(zhǎng)，說明10 mmol·L-13′AT能夠抑制HIS3報(bào)告基因的背景表達(dá)，后續(xù)可用TDO/X/3′AT(10 mmol·L-1)進(jìn)行文庫篩選。

圖2 pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體自激活性及毒性檢測(cè)Fig.2 Detection of self-activation and toxicity of pGBKT7-NtMYB4a bait vector

2.3 酵母雙雜交篩選NtMYB4a的互作蛋白

將pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體AH109酵母和cDNA文庫Y187酵母進(jìn)行雜交，利用顯微鏡觀察雜交液中結(jié)合生長(zhǎng)子的產(chǎn)生情況(圖3-A)，酵母雜交液中有三葉草結(jié)構(gòu)的形成，說明酵母細(xì)胞雜交成功。將結(jié)合生長(zhǎng)子進(jìn)行加壓培養(yǎng)，在TDO/X/3′AT(10 mmol·L-1) 平板上酵母正常生長(zhǎng)(圖3-B)；再進(jìn)一步加壓培養(yǎng)，將TDO/X/3′AT平板上的78個(gè)單克隆全部點(diǎn)種在QDO/A/X平板上進(jìn)行第2次篩選，觀察菌落的生長(zhǎng)情況(圖3-C)，在QDO/A/X平板上有72個(gè)藍(lán)色菌斑正常生長(zhǎng)。

注：A：結(jié)合生長(zhǎng)子鏡檢圖；B：雜交液TDO平板培養(yǎng)；C：?jiǎn)慰寺DO平板培養(yǎng)。Note：A: Combined with growth microscopy. B: Plate culture of hybrid liquid TDO. C: Monoclonal QDO plate culture.圖3 酵母細(xì)胞結(jié)合生長(zhǎng)圖Fig.3 Diagram of yeast cell binding growth

將經(jīng)過QDO/A/X培養(yǎng)篩選所得的72個(gè)藍(lán)色菌株抽提質(zhì)粒，利用pGADT7通用引物對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)驗(yàn)證，對(duì)表現(xiàn)為陽性所對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序(圖4)，其中部分蛋白存在高級(jí)結(jié)構(gòu)，測(cè)序失敗。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，合并重復(fù)序列，去掉載體序列，初步獲得39個(gè)可能與NtMYB4a互作的候選蛋白，包括天冬氨酸蛋白酶、N-α-乙酰轉(zhuǎn)移酶、RALF蛋白質(zhì)、果糖二磷酸醛縮酶、核糖體蛋白、過氧化氫酶同工酶、鋅指AN1、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SEC13、液泡分選蛋白、B2蛋白、應(yīng)激增強(qiáng)蛋白等(表3)。

圖4 互作陽性克隆PCR檢測(cè)Fig.4 PCR detection of interaction positive clones

表 3 酵母雙雜交篩選的候選NtMYB4a互作蛋白Table 3 Candidate NtMYB4a-interacting proteins screened by Y2H

2.4 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證互作蛋白

將獵物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并抽提質(zhì)粒，然后再將獵物質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。共轉(zhuǎn)化的酵母菌在 SD/-Leu/-Trp 平板上生長(zhǎng)良好(圖5)。將長(zhǎng)至2～3 mm的陽性克隆進(jìn)行1∶10∶100稀釋后，進(jìn)行加壓培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)4、6、14、15、32和33號(hào)靶蛋白在缺陷培養(yǎng)基 SD/-Leu/-Trp、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X平板上均能正常生長(zhǎng)，并能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X 平板上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落(圖6)，說明4、6、14、15、32和33號(hào)靶蛋白排除了假陽性的可能，與煙草NtMYB4a具有相互作用。

圖5 共轉(zhuǎn)化酵母SD/-Leu/-Trp平板生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of SD/-Leu/-Trp plates of co-transformed yeast

圖6 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證互作蛋白Fig.6 Rotation verification of interacting proteins

2.5 與NtMYB4a互作的候選蛋白的功能預(yù)測(cè)

測(cè)序經(jīng)BLAST比對(duì)及酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證后，最終獲得6個(gè)與NtMYB4a互作的陽性靶蛋白，其功能預(yù)測(cè)如表4所示。

表4 酵母雙雜交篩選的候選NtMYB4a互作蛋白功能預(yù)測(cè)Table 4 Candidate NtMYB4a-interacting proteins and its functional prediction screened by Y2H

2.6 低溫脅迫下NtMYB4a與候選蛋白基因的表達(dá)分析

由圖7所示，NtB2、NtSEP1、NtVPS20與NtMYB4a的表達(dá)模式一致，呈倒“V”型，表現(xiàn)為0至24 h逐漸增加，并在24 h時(shí)達(dá)到最大值，36 h時(shí)降到最低值；而NtAN15K、NtRALF22和NtAPN1K基因的表達(dá)變化模式相似，呈“N”型，不同的是NtAN15K在12 h時(shí)增加到最大值后降低，而NtRALF22在24 h時(shí)增加到最大值后降低，三者都在36 h時(shí)降低，48 h時(shí)顯著升高。

圖7 低溫脅迫下相關(guān)蛋白基因的動(dòng)態(tài)變化模式Fig.7 Dynamic change patterns of related protein genes under low temperature stress

NtMYB4a、NtB2、NtAN15K、NtRALF22和NtVPS20這5個(gè)基因表達(dá)水平在12、24 h都較0 h顯著增加。綜上所述，在低溫脅迫下，6種候選蛋白基因和NtMYB4a基因的表達(dá)均整體呈增加—降低—增加的變化趨勢(shì)。

基因表達(dá)相關(guān)性分析(圖8)表明，NtVPS20和NtB2與NtMYB4a呈顯著正相關(guān)關(guān)系；NtRALF22和NtSEP1與NtMYB4a呈正相關(guān)關(guān)系；NtAN15K和NtAPN1K與NtMYB4a呈較弱負(fù)相關(guān)關(guān)系。NtRALF22和NtB2與其他5種蛋白互為正相關(guān)關(guān)系；NtAN15K與NtSEP1、NtVPS20呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

注：無圓圈方格表示各指標(biāo)間無顯著性差異，藍(lán)色表示正相關(guān)，紅色表示負(fù)相關(guān)；圓圈越大、顏色越深表示指標(biāo)間相關(guān)性越顯著。Note: Uncircled squares indicate that there is no significant difference among indicators, blue indicates positive correlation, red indicates negative correlation. The larger the circle and the darker the color, the more significant the correlation between indicators.圖8 低溫脅迫后NtMYB4a與互作蛋白基因表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis of NtMYB4a and interacting protein gene expression under low temperature stress

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)的產(chǎn)生是基于對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子特別是酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究[7]。該技術(shù)在核酸水平上操作，避免了蛋白質(zhì)的分離和純化過程，保證了蛋白質(zhì)的活性，也能夠直接真實(shí)地反映蛋白之間的互作用。因此，酵母雙雜交技術(shù)具有靈敏度較高、操作簡(jiǎn)潔，且在一定程度上體現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)部情況[2]的特點(diǎn)。但此方法具有一定的局限性，如假陽性和假陰性率較高。屈瑩[8]通過酵母雙雜交初步篩選到40個(gè)蛋白與BsMYB62互作，驗(yàn)證后得到12個(gè)候選互作蛋白。楊潔[9]通過酵母雙雜交初步篩選到236個(gè)與SmMYB36互作的蛋白，分析驗(yàn)證后得到28個(gè)候選互作蛋白。若誘餌蛋白和獵物蛋白單獨(dú)或結(jié)合后存在毒性，酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)會(huì)受到影響，引起假陰性現(xiàn)象；若誘餌蛋白存在自激活性，獵物蛋白與之結(jié)合后同樣存在自激活性，可激活報(bào)告基因，從而引起假陽性現(xiàn)象[10]。目前通常通過配置不同濃度的缺陷培養(yǎng)基、回轉(zhuǎn)驗(yàn)證互作蛋白等試驗(yàn)方法降低假陽性現(xiàn)象。劉靜等[11]選用含45 mmol·L-13-AT的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行文庫篩選，可抑制pGBKT7-BsMYB62的自激活現(xiàn)象；張竹君等[12]篩選后使用0.2 mg·L-1ABA濃度下的SD/-Leu-Trp/X-α-Gal/AbA缺陷培養(yǎng)基對(duì)pGBKT7-RhRD22誘餌蛋白無自激活效應(yīng)，并用其進(jìn)行文庫篩選。本研究構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-NtMYB4a無毒性但有自激活現(xiàn)象，經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)10 mmol·L-13′AT的SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal缺陷培養(yǎng)基可抑制pGBKT7-NtMYB4a的自激活現(xiàn)象。利用該培養(yǎng)基對(duì)煙草cDNA文庫進(jìn)行篩選，初步獲得39個(gè)可能與NtMYB4a互作的候選蛋白。為進(jìn)一步降低假陽性的概率，采用回轉(zhuǎn)驗(yàn)證方法進(jìn)一步篩選，得到6個(gè)陽性蛋白，分別是RALF-like 22蛋白、鋅指A20/AN1結(jié)構(gòu)域蛋白、液泡分選蛋白、天冬氨酸蛋白酶、B2蛋白和應(yīng)激增強(qiáng)蛋白。

采用qRT-PCR技術(shù)分析以上6個(gè)基因在4℃低溫脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)上述基因均與NtMYB4a的表達(dá)模式相似，其中NtVPS20和NtB2的表達(dá)與NtMYB4a的表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。液泡分選蛋白(Vacuolar sorting protein, Vps)是一類介導(dǎo)細(xì)胞器間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白[13]，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)答生物與非生物脅迫等。如油茶(CamelliaoleiferaAbel)CfVPS26參與調(diào)控果生刺盤孢生長(zhǎng)發(fā)育[14]；黃瓜(CucumissativusL.)CmVPS參與黃瓜花葉病(CucumberMosaicVirus，CMV)的調(diào)控，有抑制CMV表達(dá)的作用[15]；擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtVPS25參與調(diào)控主根發(fā)育[16]。低溫脅迫下AtVPS28A和AtVPS28B參與質(zhì)膜上的生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體蛋白PIN1的表達(dá)，調(diào)節(jié)相關(guān)代謝物的平衡，從而增強(qiáng)植物的耐寒性[17]，因此，結(jié)合前人發(fā)現(xiàn)和本研究結(jié)果推測(cè)，NtMYB4a可能與NtVPS20互作，影響生長(zhǎng)素對(duì)低溫的應(yīng)答。而B2蛋白是一個(gè)由RNA3編碼的含有106個(gè)氨基酸的小蛋白，在辣椒[18]中具有抗病性，小麥[17]中通過改變脫落酸的信號(hào)傳導(dǎo)響應(yīng)干旱脅迫，從而調(diào)控植物生長(zhǎng)。但NtMYB4a與NtB2是否形成復(fù)合蛋白來響應(yīng)環(huán)境脅迫有待進(jìn)一步研究。

其余4個(gè)候選互作蛋白基因雖然在低溫脅迫下的表達(dá)與NtMYB4a的相關(guān)性不顯著，但也有相關(guān)研究表明他們參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)答生物或非生物脅迫等過程?？焖賶A化蛋白(Rapid alkalinization factors，RALFs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種植物多肽類信號(hào)分子，具有參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的生理作用[20]，如阻止根系生長(zhǎng)和發(fā)育[21]、參與調(diào)控植物花粉與雌蕊之間的互作[22]等。A20/AN1型鋅指蛋白(Zinc-finger proteins, ZFPs)是一類含有A20鋅指、AN1鋅指或二者并存的蛋白質(zhì)[23]，在植物中有參與非生物脅迫應(yīng)答的功能[24]，如水稻OsSAP[25-26]和番茄SAP[27]參與響應(yīng)干旱、低溫、鹽等逆境脅迫。天冬氨酸蛋白(Aspartic proteinase)參與了植物體內(nèi)細(xì)胞器的降解、蛋白質(zhì)的加工和降解過程及激素調(diào)控的衰老機(jī)制等過程[28]，還參與植物逆境脅迫反應(yīng)，響應(yīng)干旱脅迫的應(yīng)答[29-30]。煙草應(yīng)激增強(qiáng)蛋白1來源于葉綠體，但關(guān)于其功能方面的研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NtMYB4a基因參與響應(yīng)PEG、鹽、低溫和MeJA等非生物脅迫的響應(yīng)，還參與花青素、綠原酸的合成[31]。本研究?jī)H采用qRT-PCR驗(yàn)證了這6個(gè)基因在低溫下與NtMYB4a的共表達(dá)情況，無顯著相關(guān)性的4個(gè)候選蛋白可能與NtMYB4a互作參與調(diào)控?zé)煵莸纳L(zhǎng)發(fā)育過程，或響應(yīng)除低溫脅迫外的非生物脅迫。后期將通過免疫共沉淀和雙分子熒光互補(bǔ)等技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)6個(gè)候選互作蛋白與NtMYB4a的互作關(guān)系，并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，為揭示NtMYB4a與其互作參與調(diào)控?zé)煵蓓憫?yīng)非生物脅迫或參與花青素合成的分子機(jī)制提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建PGBKT7-NtMYB4a誘餌蛋白，利用酵母雙雜交技術(shù)，從煙草cDNA文庫篩選到6個(gè)與NtMYB4a互作的蛋白，分別是煙草RALF-like 22(NtRALF22，XP_016459104.1)、煙草鋅指A20/AN1結(jié)構(gòu)域(NtAN1，XP_016468512.1)、煙草液泡蛋白分選蛋白(NtVPS20，XP_009590586.1)、煙草天冬氨酸蛋白酶(NtAPN1K，XP_016511411.1)、煙草B2蛋白(NtB2，XP_016497753.1)和煙草應(yīng)激增強(qiáng)蛋白1(NtSEP1，XM_016495253.1)。qRT-PCR分析結(jié)果表明低溫脅迫下這6個(gè)候選互作蛋白的基因表達(dá)模式與NtMYB4a表達(dá)相似，其中NtVPS20和NtB2的表達(dá)與NtMYB4a的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，推測(cè)NtMYB4a可能與這2種蛋白互作參與煙草低溫響應(yīng)。