胡學(xué)佳 戴志遠(yuǎn) 張曉頔 董 燁 金仁耀

(浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012)

高血壓是一種常見的慢性醫(yī)學(xué)疾病，影響著全世界大約30%的成年人[1]。每年高血壓造成的死亡人數(shù)高達(dá)940萬之多，但高血壓疾病無明顯病癥，因此又被稱為“無聲殺手”[2]。高血壓疾病會因血管持續(xù)承受過度的壓力泵送血液，從而導(dǎo)致冠心病、外周動脈疾病、動脈硬化、腎臟疾病和中風(fēng)等高風(fēng)險疾病[3]。目前，安全性高、無毒副作用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotension converting enzyme, ACE)抑制肽是治療高血壓最有效的方法，其通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的活性，阻礙血管緊張素Ⅱ的生成，并抑制血管舒緩激肽的分解，從而達(dá)到降血壓的作用[4]。自1980年，從天然蛇毒蛋白中提取出第一個ACE抑制肽以來[5]，源于動物或植物的新型ACE抑制肽的開發(fā)研究就備受關(guān)注[6-7]。近年來，國內(nèi)外研究學(xué)者通過直接提取、酶解、發(fā)酵和化學(xué)合成等方法，已經(jīng)成功從牛奶[8]、雞蛋[9]、海魚[10]、大豆及其副產(chǎn)品[11]中制備出ACE抑制肽，經(jīng)過進(jìn)一步超濾，反相高效液相色譜等方法對其進(jìn)行分離純化得到活性較好的ACE抑制肽。利用超濾和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)對其進(jìn)一步分離純化，制得高活性ACE抑制肽。我國作為水產(chǎn)大國，水產(chǎn)品以其較高的產(chǎn)量和豐富的蛋白含量成為提取ACE抑制肽的理想來源。

紅娘魚(Lepidotriglakishinouyi)隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)魴鮄科(Triglidae)紅娘魚屬(Lepidotrigla)，分布于西北太平洋區(qū)[12]。紅娘魚作為海產(chǎn)小雜魚，個頭較小，群體產(chǎn)量高，生長繁殖速度快，含有豐富的蛋白質(zhì)，但經(jīng)濟(jì)價值不高，大部分被作為魚肥和魚飼料使用[13]。目前采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化并結(jié)合酶解法制備紅娘魚魚糜蛋白降血壓肽工藝的研究鮮見報道。因此，本研究以單因素試驗為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化紅娘魚魚糜蛋白制備降血壓肽的工藝條件，并對其分子質(zhì)量分布和體外抗氧化活性進(jìn)行測定，旨在開發(fā)制備紅娘魚降血壓肽，從而提高紅娘魚的利用率和產(chǎn)業(yè)附加值，為實踐生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅娘魚，浙江海欣水產(chǎn)有限公司；中性蛋白酶(Neutrase?0.8 L，1.1×105U·g-1)、復(fù)合蛋白酶(Protemax?，1.5×105U·g-1)、堿性蛋白酶(Alcalase?AF 2.4 L，1.3×105U·g-1)、木瓜蛋白酶(Papain?，9.0×104U·g-1)，風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme?500 MG，8.0×104U·g-1)，均購自丹麥Novozymes公司；馬尿酸(hippuric acid, HA)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)、鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde, OPA)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-histidyl-leucine, HHL)、抑肽酶、細(xì)胞色素C、碳酸酐酶、桿菌肽等均購自美國Sigma公司； 聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒，南京碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DSHZ-300A旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠；Spectra MAX 190酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；Fresco 21冷凍高速離心機(jī)、EVOLUTION 60S紫外分光光度計，美國Thermo Fisher公司；400Y多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；DGG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；QL-8bb-253旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；E2695高效液相色譜，美國Waters公司；其余試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅娘魚蛋白的提取 取紅娘魚魚肉100 g，切碎放入攪拌機(jī)攪碎，將魚糜放入研缽加液氮研磨成粉，加入500 mL磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline, PBS)，使用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)5 min，隨后進(jìn)行超聲破碎。將處理好的樣品進(jìn)行離心，收集上清液中的可溶性蛋白，將1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)和30%三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)以1∶2(v/v)比例加入上清液中，混合30 min，離心去上清液，將白色沉淀冷凍干燥得到紅娘魚蛋白。

1.3.2 酶解試驗 取凍干的紅娘魚蛋白，研磨成粉，按料液比1∶40(g∶mL)的比例加入去離子水，將所得懸浮液使用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)5 min，進(jìn)行酶解。工藝流程：樣品溶液—蛋白酶酶解—沸水浴15 min滅酶活—8 000 r·min-1、 4℃離心20 min—上清液冷凍干燥-20℃儲存待用。

1.3.2.1 蛋白酶的篩選 將中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶以2 400 U·g-1添加到樣品溶液中，在恒溫振蕩水浴鍋中以5種酶適宜條件(表1)對樣品進(jìn)行酶解，通過添加1 mol·mL-1HCl和1 mol·mL-1NaOH來調(diào)控水解過程中的pH值，以ACE抑制率和水解度為指標(biāo)，選出最佳的蛋白酶。

表1 不同蛋白酶制備ACE抑制肽的最佳條件Table 1 Optimum condition for the preparation of ACE inhibitory peptide using different enzymes

1.3.2.2 單因素試驗 酶底比對紅娘魚酶解效果的影響：在酶解溫度55℃、pH值9、酶解時間3 h條件下，設(shè)定不同的酶底比0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.8。

水解溫度對紅娘魚酶解效果的影響：在酶底比1.4、pH值9、酶解時間3 h條件下，設(shè)定不同的水解溫度40、45、50、55和60℃。

pH值對紅娘魚酶解效果的影響：在酶底比1.4、酶解溫度55℃、酶解時間3 h條件下，設(shè)定不同的pH值7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。

水解時間對紅娘魚酶解效果的影響：在酶底比1.4、酶解溫度55℃、pH值9條件下，設(shè)定不同的水解時間30、60、90、120、150、180、210、240 min。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 參照單因素的試驗結(jié)果，使用Design Expert 8軟件，以pH值(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)和酶底比(D)為自變量，ACE抑制率為因變量設(shè)計響應(yīng)面。

1.3.4 水解度測定 采用Spellman等[19]的方法并加以改進(jìn)。取紅娘魚酶解液200 μL放于離心管中，加入1.5 mL OPA，震蕩混勻后靜置3 min，在340 nm波長處測定樣品吸光度值。測定時以去離子水為空白組，100 mg·L-1絲氨酸溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算魚鱗酶解液中游離氨基含量，并按照公式計算水解度：

1.3.5 ACE抑制率的測定 采用Cushman等[20]的方法并加以改進(jìn)。量取25 μL酶解液，加入25 μL ACE(0.1 U·mL-1)，混合均勻并于37℃恒溫保持5 min，加入75 μL馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-histidyl-leucine, HHL)溶液(5 mmol·L-1)和25 μL去離子水，旋渦混勻于水浴鍋中37℃反應(yīng)30 min。待反應(yīng)結(jié)束加入250 μL HCl(1 mol·L-1)終止反應(yīng)，之后加入乙酸乙酯1.5 mL，將混合液于4 000 r·min-1離心10 min后。吸取1 mL上清液，于120℃烘箱靜置30 min，冷卻至室溫后添加去離子水3 mL，超聲波震蕩混勻5 min，測定228 nm下的吸光值。按照公式計算ACE抑制率：

式中，OD1為不添加紅娘魚酶解液的溶液在228 nm波長處的吸光度；OD2為添加ACE和紅娘魚酶解液的溶液在228 nm波長處的吸光度；OD3為不加ACE的溶液在228 nm波長處的吸光度。

1.3.6 紅娘魚魚肉酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布測定 參照蔣騰川等[21]的方法并稍作修改。采用HPLC法測定紅娘魚魚肉水解物的相對分子質(zhì)量分布。其中，檢測器：UV/Vis檢測器；色譜柱：TSKgel G2000-SWx1(7.8 mm×300 mm)；流動相：由體積比為45∶55的A液和B液組成，其中A液為乙腈，B液為0.1% TFA，等度洗脫；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。分別稱取抑肽酶(6 500 Da)、細(xì)胞色素C(12 400 Da)、 碳酸酐酶(29 000 Da)和HHL(429 Da)標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg加入1 mL水中溶解，進(jìn)行分析，記錄色譜圖，繪制校準(zhǔn)曲線。樣品質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1，0.45 μm的濾膜過濾，以相同色譜分析條件進(jìn)行檢測，根據(jù)校準(zhǔn)曲線計算樣品相對分子質(zhì)量及其分布范圍。

1.3.7 體外抗氧化活性的測定

1.3.7.1 DPPH·清除率的測定 參照J(rèn)amdar等[22]的方法并稍作修改。取2 mL樣品溶液與2 mL 1×10-4mol·L-1的DPPH溶液混合均勻，在室溫條件下，避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度。按照公式計算清除率：

式中，A1為添加紅娘魚酶解液和DPPH溶液時測得的吸光度；A2為添加紅娘魚酶解液，不添加DPPH溶液時測得的吸光度；A3為不添加紅娘魚酶解液，加入DPPH溶液時測得的吸光度。

1.3.7.2 還原力的測定 還原力的測定是以樣品是否是良好的供應(yīng)體為指標(biāo)，良好的電子供體可與自由基結(jié)合形成惰性物質(zhì)，從而中斷氧化鏈鎖反應(yīng)[23]。取2 mL樣品溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol·L-1，pH值6.6)和2.5 mL鐵氰化鉀(1%)，混合均勻后，于50℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束放置于冰水混合物中進(jìn)行快速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸以終止反應(yīng)，8 000 r·min-1離心8 min，取2.5 mL上清液加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵和2.5 mL蒸餾水，混合均勻，于50℃下靜置10 min，在700 nm下測定吸光度[24]，空白組試驗為蒸餾水代替樣品溶液。

1.3.7.3 羥基自由基(·OH)清除率的測定 取2 mL的樣品溶液，加入0.05 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、0.2 mL超純水、0.05 mL 9 mmol·L-1FeCl2溶液，最后加入0.05 mL 8.8 mmol·L-1H2O2溶液啟動反應(yīng)，混合均勻后37℃反應(yīng)30 min，在510 nm波長處測定吸光度[25]。按照公式計算·OH清除率:

式中，A為添加紅娘魚水解液的吸光度；A0為不添加紅娘魚酶解液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，采用多重比較分析法對各組進(jìn)行顯著性檢驗(P<0.05)，采用Design Expert 8軟件分析數(shù)據(jù)，構(gòu)建響應(yīng)面，使用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅娘魚酶解蛋白酶篩選

選取5種蛋白酶對紅娘魚蛋白進(jìn)行酶解，以ACE抑制率和水解度為指標(biāo)，篩選出最佳蛋白酶。由圖1可知，ACE抑制率與水解度呈正相關(guān)，即隨著水解度的增大，ACE抑制率也呈上升趨勢。其中，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度和ACE抑制率均顯著高于其他組(P< 0.05)。因此選擇堿性蛋白酶作為制備紅娘魚降血壓肽的蛋白酶種類。

注：不同字母表示同一指標(biāo)間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different letters indicate significant difference between the same indicators at 0.05 level. The same as following.圖1 不同蛋白酶種類對紅娘魚魚肉酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of different protease on the DH and ACE inhibition rate of Lepidotrigla kishinouyi hydrolysates

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

由圖2-A可知，隨著酶與底物的比值增加，紅娘魚酶解產(chǎn)物的水解度不斷增高，在酶底比為1.1%時，水解度達(dá)到最高值，之后紅娘魚酶解產(chǎn)物的水解度值逐漸下降。當(dāng)酶與底物的比值為0.2%～1.4%時，ACE抑制率呈逐漸升高趨勢，在酶底比為1.4%時達(dá)到最大值。繼續(xù)增加酶底比，ACE抑制率出現(xiàn)下降趨勢。因此選擇1.4%為最佳酶底比。

由圖2-B可知，在40～55℃范圍內(nèi)，ACE抑制率和水解度均處于增加狀態(tài)，表明在未達(dá)到最適溫度前，溫度起著關(guān)鍵作用，溫度的升高加快了分子運動，從而使反應(yīng)速率加快，進(jìn)而影響ACE抑制率和水解度。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，蛋白酶會發(fā)生變性，影響酶活性，降低反應(yīng)速率，減少ACE抑制肽的生成。因此，選取55℃為最適酶解溫度。

由圖2-C可知，當(dāng)pH值為8.5時，ACE抑制率和水解度均達(dá)到最大值，在最適pH值條件下，酶和蛋白質(zhì)中的解離基團(tuán)更容易結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成ACE抑制肽影響ACE抑制率和水解度。若偏離蛋白酶的最適pH值，輕則酶活性受到影響，重則直接失活。因此，選擇pH值8.5為酶解最適條件。

由圖2-D可知，隨著酶解時間的延長，水解度呈現(xiàn)遞增的趨勢，ACE抑制率先逐漸遞增，在120 min時達(dá)到最大值后呈現(xiàn)下降趨勢。分析原因可能是酶解時間越長，水解度越高，已生成的ACE抑制肽也在蛋白酶作用下進(jìn)一步水解，進(jìn)而造成ACE抑制率降低。綜合考慮，選取120 min為紅娘魚的最優(yōu)酶解時間。

圖2 單因素條件對紅娘魚魚肉酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of single factors on the DH and ACE inhibition rate of Lepidotrigla kishinouyi hydrolysates

2.3 響應(yīng)試驗結(jié)果分析

2.3.1 模型擬合 參照單因素的試驗結(jié)果，使用Design Expert 8軟件，以pH值(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)和酶底比(D)為自變量，ACE抑制率為因變量設(shè)計響應(yīng)面，試驗設(shè)計和結(jié)果見表2。得到多元回歸方程：

Y=92.54+1.23A+0.91B-1.21C+1.27D+1.87AB-2.15AC-0.15AD+0.57BC+3.28BD+2.85CD-4.57A2-3.47B2-3.17C2-6.29D2。

由表3可知，該回歸模型差異極顯著(P<0.01)，失擬項P=0.453 1>0.05，不顯著，故該模型合理。F值顯示了自變量對因變量的影響程度，各自變量對ACE抑制率的影響程度表現(xiàn)為酶底比>pH值>酶解時間>酶解溫度。相關(guān)系數(shù)R2=92.54>90，故該模型擬合程度良好，較為可靠[26-27]。因此，可使用此模型進(jìn)行ACE抑制肽最佳制備工藝的分析和預(yù)測。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 Table 2 Design and results of the response surface experiments

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model

2.3.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面可以描述各變量間的相互作用，預(yù)測因素的最佳條件值[28-29]。三維曲面的傾斜度可表示各因素對ACE抑制率的影響程度，傾斜度大即坡度越陡峭則該因素對ACE抑制率的影響顯著，傾斜度小即坡度平緩則該因素對ACE抑制率的影響不顯著[30]。由圖3可知，各因素對ACE抑制率影響程度的大小關(guān)系為酶底比>pH值>酶解時間>酶解溫度。等高線的形狀反映各因素間交互作用的程度，等高線的形狀為橢圓形說明因素間的交互作用顯著，圓形則說明因素間的交互作用不顯著[31]。由圖3可知，pH值與酶解時間、酶解溫度與酶底比、酶解時間與酶底比交互作用顯著。

圖3 各因素交互作用對紅娘魚酶解物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of interaction of various factors on ACE inhibition rate of lepidotrigla kishinouyi hvdrolvsates

經(jīng)分析，回歸模型預(yù)測的最佳反應(yīng)條件為酶底比0.8%，pH值9、溫度54℃、時間2 h，在此條件下酶解所制得的降壓多肽ACE抑制率理論值為88%。

2.4 分子質(zhì)量分布情況

標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC測定結(jié)果如圖4所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對數(shù)與保留時間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-A)，得回歸方程為y=-0.202 5x+6.875 1，R2=0.975 8。 測定紅娘魚酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量(圖4-B)的保留時間分別為18.441、19.962、21.406和25.006 min，代入回歸方程求得相對分子質(zhì)量分別為 1 382.9、 680.4、347和64.8 Da。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的酶解條件下，紅娘魚魚肉酶解徹底，相對分子質(zhì)量分布較小，均小于2 000 Da。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品分子(A)和酶解產(chǎn)物(B)相對分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.4 Chromatography of relative molecular mass distribution of standards(A) and hydrolysate(B)

2.5 抗氧化活性

紅娘魚酶解產(chǎn)物對抗氧化活性的影響如圖5所示。由圖5-A可知， DPPH·清除率和樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，樣品質(zhì)量濃度越高，DPPH·清除率越高。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1～2 mg·mL-1時，Vc對DPPH·的清除率較高；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到3 mg·mL-1時，紅娘魚酶解產(chǎn)物和Vc對DPPH·清除率基本相同；之后隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，紅娘魚酶解產(chǎn)物對DPPH的清除率始終高于Vc。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到7 mg·mL-1時，紅娘魚酶解產(chǎn)物和Vc對DPPH·清除率較高，分別為75.68%和70.91%，之后影響速率變緩。結(jié)果表明，當(dāng)紅娘魚酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度大于3 mg·mL-1時具有較強(qiáng)的DPPH·清除率。

由圖5-B可知，·OH清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，在樣品質(zhì)量濃度為1～4 mg·mL-1時，·OH清除率增長速度較快；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1～3 mg·mL-1時，Vc的·OH清除率較大；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4～8 mg·mL-1時，紅娘魚酶解產(chǎn)物的·OH清除率較大；樣品質(zhì)量濃度為7 mg·mL-1時，紅娘魚酶解產(chǎn)物和Vc的·OH清除率達(dá)到最高，分別為92.26%和88.56%，隨后隨著樣品質(zhì)量濃度增大，·OH清除率變化不大。結(jié)果表明，當(dāng)紅娘魚酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度大于4 mg·mL-1時具有較強(qiáng)的·OH清除率。

由圖5-C可知，紅娘魚酶解產(chǎn)物和Vc的還原力在樣品質(zhì)量濃度1～7 mg·mL-1時迅速上升，在樣品質(zhì)量濃度為7 mg·mL-1時，紅娘魚酶解產(chǎn)物和Vc的還原力較高，分別為0.91和0.78，之后隨樣品質(zhì)量濃度的增加，還原力變化不大。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1～3 mg·mL-1的時候，Vc還原力較高；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為 3 mg·mL-1的時候，紅娘魚酶解產(chǎn)物和Vc還原力相當(dāng)；之后隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，紅娘魚酶解產(chǎn)物的還原力始終高于Vc。結(jié)果表明，當(dāng)紅娘魚酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度大于3 mg·mL-1時具有較強(qiáng)的還原力。

注：不同大寫字母表示同一酶解物不同濃度間存在顯著差異(P<0.05)；不同小寫字母表示相同濃度下酶解物和Vc間存在顯著差異(P<0.05)。Note: Different capital letters indicate a significant difference at 0.05 level between different concentrations in the same hydrolysate. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level between hydrolysates and Vc in the same sample concentrations.圖5 紅娘魚魚肉酶解產(chǎn)物濃度與抗氧化活性關(guān)系圖Fig.5 The relationship between the concentration of Lepidotrigla kishinouyi hydrolysates and antioxidant activity

體外抗氧化試驗結(jié)果表明，紅娘魚酶解產(chǎn)物的體外抗氧化性較強(qiáng)，其DPPH·清除率、·OH清除率和還原力的IC50值分別為4.612、1.121和3.716 mg·mL-1。

3 討論

紅娘魚產(chǎn)量高，且蛋白質(zhì)含量豐富，但產(chǎn)品附加值低，大部分被用作飼料，造成了很大的資源浪費。近年來ACE抑制肽從不同食品中開發(fā)出來，如玉米、大豆和藻類等。但以紅娘魚為原料開發(fā)ACE抑制肽的研究甚少。酶解法是目前獲得降血壓肽最常用的方法，通過選用合適的酶，在最優(yōu)的反應(yīng)條件下使ACE抑制肽活性片段得以釋放。通過優(yōu)化本研究選用堿性蛋白酶酶解紅娘魚魚肉，F(xiàn)orghani等[32]發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶的酶切位點就是疏水性氨基酸C末端的肽鍵，因此酶解產(chǎn)物具有較高的ACE抑制活性。李肖肖[33]采用堿性蛋白酶酶解牡蠣，在酶解時間4 h、pH值9.0、溫度50℃、料液比1∶4(g∶mL)的條件下制備的ACE抑制肽的抑制率達(dá)60.44%。Roslan等[34]采用堿性蛋白酶水解羅非魚制備ACE抑制肽，最佳工藝條件為：酶添加量2.5%、pH值7.5、酶解溫度60℃、酶解時間1.60 h。徐杰等[35]以羅非魚為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化中性蛋白酶酶解羅非魚的工藝條件為：酶添加量1.91%、pH值7、酶解溫度50℃、酶解時間2.65 h，ACE抑制率可達(dá)67.4%。以上研究采用的酶和工藝條件雖有所不同，但優(yōu)化的結(jié)果與本試驗相接近，說明酶解不同蛋白制備降血壓肽具有一定的相似性，但相比以往的研究結(jié)果，本研究酶解效率更高，酶添加量也更少，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。

分子質(zhì)量是影響ACE抑制肽活性的主要因素之一。涂丹等[36]以羅非魚魚鱗為原料，采用堿性蛋白酶制備魚鱗蛋白ACE抑制肽，結(jié)果表明相對分子質(zhì)量在300～3 000 Da之間的ACE抑制肽活性最高。Nakajima等[37]研究表明相對分子質(zhì)量分布于700～2 00 Pa 間的魚肌肉酶解液具有較高的ACE抑制活性，其中ACE抑制肽活性最高的組分分子質(zhì)量為 1 350 Da。 本研究采用HPLC測定相對分子質(zhì)量，結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布集中在60～2 000 Da之間，并具有良好的ACE抑制活性，與上述研究結(jié)果一致。體外抗氧化活性是判斷酶解產(chǎn)物穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。本研究通過測定酶解產(chǎn)物樣品清除DPPH·、 ·OH 及還原力評價了其體外抗氧化活性，結(jié)果表明酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，分析主要有以下三方面原因[38]：其一，酶解產(chǎn)物和Fe2+結(jié)合阻止了OH的生成，從而抑制了自由基的產(chǎn)生；其二，水解產(chǎn)物作為電子供體，將Fe3+還原成Fe2+，其還原力與酶解產(chǎn)物中的活性氨基酸和肽段有關(guān)；其三，紅娘魚蛋白酶解后，疏水性氨基酸暴露，作為氫供體與DPPH反應(yīng)，阻止自由基產(chǎn)生。綜上所述，本研究以紅娘魚為原料制備的酶解產(chǎn)物具有較好的降壓活性和較強(qiáng)的抗氧化穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本研究運用響應(yīng)面分析方法對紅娘魚魚肉酶解制備降壓肽工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最優(yōu)蛋白酶為堿性蛋白酶，最佳工藝條件為酶底比1.4%、pH值9、溫度54℃、時間2 h，此條件下酶解所制得的降壓多肽ACE抑制率為89.3%。在最優(yōu)條件下制備的酶解產(chǎn)物，分子質(zhì)量分布集中在60～2 000 Da之間， DPPH·清除能力IC50值為4.612 mg·mL-1；·OH清除能力IC50值為1.121 mg·mL-1；還原力IC50值為3.716 mg·mL-1。 本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化紅娘魚魚肉制備降壓肽工藝，所得的制備條件有效可行，且酶解產(chǎn)物具有良好的體外抗氧化活性，但此研究只對紅娘魚制備降血壓肽的制備工藝進(jìn)行了初步探索，今后可通過動物試驗、分子對接等對其降壓機(jī)制進(jìn)行更深入的分析。