張桂林，張亞亭，姜 宏，劉 振，毛相朝,

1. 中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266003

2. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237

巖藻黃質是一種類胡蘿卜素，在自然界中分布廣泛，主要存在于藻類、貝類中，尤其在褐藻、硅藻中含量較高。巖藻黃質可以與葉綠素、蛋白質形成捕光復合體，是硅藻中發(fā)揮捕光作用的重要化合物[1]。目前有關巖藻黃質活性的報道較多，研究表明巖藻黃質具有抑菌、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病、抗腫瘤、調節(jié)腸道菌群和抗器官纖維化等生理活性[2-6]。

目前巖藻黃質的最主要來源依舊是海藻[7]，例如海帶 (Laminaria japonica)、三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)[8]。巖藻黃質是一種優(yōu)質的海洋來源功能因子，但由于其合成途徑目前尚未得到完全解析，其生產及產量調控尚缺乏理論依據(jù)[9-12]，合成生物學是發(fā)掘未知合成途徑的重要手段，通常需要首先在微生物中異源構建目標化合物的上游已知中間物的合成途徑，然后利用合成該中間物的工程菌株探索下游未知途徑[13]。目前已知合成途徑且結構上最接近巖藻黃質的中間物是新黃質[14]。作為巖藻黃質的可能前體物質，新黃質的結構與巖藻黃質很相似 (圖1)，兩者均含有1條多烯鏈，2個六元環(huán)和1個累積雙鍵，但存在著雙鍵、羥基和羰基、乙酰氧基的區(qū)別。

圖1 新黃質與巖藻黃質的結構式Fig. 1 Structural formula of neoxanthin and fucoxanthin

新黃質的合成途徑見圖2。甲羥戊酸 (MVA)途徑主要存在于真核生物、古生菌和植物的細胞質中，甲基赤蘚糖醇-4-磷酸 (MEP) 途徑主要存在于細菌和植物葉綠體中，丙酮酸、甘油醛-3-磷酸和乙酰輔酶A分別通過MEP途徑和MVA途徑生成MEP和MVA，再經由其他酶催化生成異戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)[15-17]。大腸桿菌中含有MEP途徑，并有法尼基焦磷酸 (FPP)可以作為巖藻黃質的底物[15,18]。

圖2 新黃質合成途徑Fig. 2 Synthetic pathway of neoxanthin

目前尚未見以微生物宿主生產新黃質的報道，因此構建合成新黃質的微生物細胞工廠成為發(fā)掘巖藻黃質的未知途徑，并進一步成為海藻高效生產巖藻黃質提供理論依據(jù)的關鍵環(huán)節(jié)。本研究以大腸桿菌 (Escherichia coli ) 為宿主，按照代謝途徑逐步構建番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃質、紫黃質的合成途徑，最終實現(xiàn)了新黃質的代謝工程合成，為進一步發(fā)掘巖藻黃質合成的未知途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

1.1.1 菌株及質粒

本文所用菌株的基因型、功能及來源見表1，質粒的基因型、功能及來源見表2。

表1 本文所用菌株Table 1 Strains in this study

表2 本文所用質粒Table 2 Plasmids in this study

1.1.2 生化試劑及藥品

番茄紅素標準品、β-胡蘿卜素標準品、玉米黃質標準品、紫黃質標準品和新黃質標準品購于Sigma-Aldrich公司。高保真DNA聚合酶試劑Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、DNA聚合酶試劑2×Taq Master Mix (Dye Plus)、重組克隆試劑ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit購于諾唯贊生物公司。凝膠萃取試劑盒E.Z.N.A?Gel Extraction Kit購于Omega Bio-Tek公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、快速質粒小提試劑盒購于天根生化科技公司。酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、氨芐青霉素、氯霉素購于索萊寶科技公司。SSCS Solution感受態(tài)制備液購于上海捷瑞生物公司。其他試劑及藥品未作特殊說明均為國藥化試分析純。PCR引物合成及測序由青島擎科公司提供。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1%的氯化鈉(NaCl，固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂粉)，115 ℃ 滅菌 30 min。

ZYP-5052培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，8.1 g·L-1磷酸氫鈉 (Na2HPO4)，6.8 g·L-1磷酸二氫鉀(KH2PO4)，3.3 g·L-1磷酸銨 [(NH4)2SO4]，0.2% 的0.5 mol·L-1硫酸鎂 (MgSO4)，2% 的 50×5052母液(50×5052母液：25%甘油，2.5%葡萄糖，10%的α-乳糖)，115 ℃ 滅菌 30 min。

氨芐青霉素溶液：溶劑為水，在培養(yǎng)基中使用的終質量濃度為 100 μg·mL-1。

氯霉素溶液：溶劑為乙醇，在培養(yǎng)基中使用的終質量濃度為 25 μg·mL-1。

1.2 方法

1.2.1 DNA 目的片段 PCR 擴增

考慮到一個質粒上需要加入多個目的片段，為了保證每個片段能夠正確表達，本研究在構建質粒的過程中會在2個目的片段的中間加入一段核糖體結合位點 (RBS)。在NCBI查找了菠蘿泛菌中crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ目的片段的CDS序列[19]。設計引物見表3，從菠蘿泛菌基因組中通過PCR擴增得到了這5個基因。ZEP3基因來自三角褐指藻[20]，NSY基因來源于番茄[21]，由華大基因全基因合成。

表3 引物序列Table 3 Primer sequence

1.2.2 質粒的構建

同源重組法構建質粒：利用高保真DNA聚合酶PCR擴增目的基因片段與質粒片段，使得各片段連接處留有15～20 bp同源序列，使用重組克隆試劑進行重組連接，將重組產物轉入E. coliTrelief?5α感受態(tài)中，涂布至對應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。12 h后對固體培養(yǎng)基上生長的轉化子進行菌落PCR驗證并選取樣品進行測序。LB培養(yǎng)基培養(yǎng)測序正確的菌株，使用快速質粒小提試劑盒提取質粒。

1.2.3 工程菌的構建

單質粒工程菌的構建：將pTrc99a-crtEBI、pTrc99a-crtEBIY和pTrc99a-crtEBIYZ質粒分別利用熱激法直接轉入E. coliBL21感受態(tài)細胞中。

雙質粒工程菌的構建：將E. coliBL21 pTrc99acrtEBIYZ工程菌制備成感受態(tài)細胞，再利用熱激法將pACYCDuet-1-QZEP3、pACYCDuet-1-QZEP3-NSY質粒轉入。感受態(tài)制備方法為：將需制成感受態(tài)的菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 h (OD600達到0.6左右)，取菌液在 4 000 r·min-1、4 ℃ 條件下離心5 min，棄上清后加入10%原菌液體積的10%無菌甘油洗滌菌體，再次離心棄上清，再重復一次甘油洗滌和離心棄上清，加入2%原菌液體積的SSCS Solution感受態(tài)制備液，即得到感受態(tài)細胞。

1.2.4 工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

將工程菌在含有對應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再挑取菌落在含有抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，得到種子液。按2%接菌量將種子液接入50 mL ZYP-5052培養(yǎng)基，20 ℃發(fā)酵48 h。

1.2.5 產物提取

大腸桿菌類胡蘿卜素提取[22]：取2.0 mL的菌液，8 000 r·min-1離心10 min留菌體，加入1 mL丙酮，在40 ℃條件下，萃取至菌體顏色全部變成白色，12 000 r·min-1離心2 min留丙酮上清。萃取液采用氮吹法進行吹干，獲得類胡蘿卜素產物，用200 μL丙酮復溶，0.22 μm尼龍濾膜去除雜質，得到待檢測樣品。

1.2.6 高效液相色譜 (HPLC) 和質譜法 (MS) 對產物的鑒定及定量分析

C30檢測方法[23]：使用YMC Carotenoid類胡蘿卜素分析色譜柱 (250×4.6 mm) 對提取產物進行分析，進樣量20 μL，吸光值476 nm，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1。具體的液相檢測條件見表4。用該方法繪制標準曲線 [y為峰面積，x為質量濃度(mg·L-1)]。番茄紅素：y=52.505x-1.670 7,R2=0.999；β-胡蘿卜素：y=1 312.9x-12.668,R2=0.999；玉米黃質：y=129.92x-39.204,R2=0.999；紫黃質：y=130.76x-33.414,R2=0.999。

表4 YMC Carotenoid流動相條件Table 4 YMC Carotenoid mobile phase conditions

上述C30色譜柱檢測方法無法分離紫黃質和新黃質，所以我們采用了另一種C18檢測方法來達到分離目的。C18檢測方法[24]：使用C18 (250×4.6 mm, 5 μm)色譜柱檢測，流動相是V(乙腈)∶V(乙酸乙酯)∶V(水)=74∶16∶10，采用等度洗脫，進樣量20 μL，吸光值440 nm，柱溫42 ℃，流速1.0 mL·min-1。用該方法繪制標準曲線 [y為峰面積，x為質量濃度 (μg·L-1)]。紫黃質：y=76.889x-140.93，R2=0.997；新黃質：y=357.07x+2.392，R2=0.991。

四極桿飛行時間質譜條件：離子源為電噴霧電離源 (ESI)；電離化方式為ESI+；毛細管溫度為350 ℃；霧化器壓力為276 kPa；干燥氣流速為10 L·min-1；掃描范圍為 m/z 20～1 000。

1.2.7 細胞干質量的測量方法

取2 mL發(fā)酵后的菌液，12 000 r·min-1離心3 min，置于85 ℃烘箱烘干24 h，測量細胞干質量[25]。根據(jù)產物濃度與細胞干質量，計算出產量單位 (細胞干質量，下同) 為 mg·g-1或 μg·g-1。

2 結果與分析

2.1 番茄紅素、 β-胡蘿卜素和玉米黃質工程菌的構建

質粒pTrc99a-crtEBI、pTrc99a-crtEBIY和pTrc99a-crtEBIYZ成功轉入E. coliBL21后，對應的工程菌E. coliBL21 pTrc99a-crtEBI、E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIY和E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIYZ發(fā)酵后菌體發(fā)生了顏色變化，對菌體內物質進行HPLC分析 (圖3)，結果表明成功產出了番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質。根據(jù)標準曲線及細胞干質量計算出各產物濃度，其中E. coliBL21 pTrc99a-crtEBI的番茄紅素產量為3.20 mg·g-1；E.coliBL21 pTrc99a-crtEBIY的β-胡蘿卜素產量為1.35 mg·g-1；E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIYZ 的玉米黃質產量為 0.70 mg·g-1。

圖3 番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質工程菌的構建Fig. 3 Construction of lycopene, β-carotene and zeaxanthin engineered bacteria

在T7啟動子的作用下，基因crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ成功表達，產出目標產物。根據(jù)HPLC結果，E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIY和E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIYZ中并沒有發(fā)現(xiàn)中間產物的積累，可能原因是產物濃度較低，CRTI、CRTY和CRTZ蛋白水平相較于低濃度產物來說催化能力較強，導致沒有中間產物的積累，也可能與菌株本身以及生長狀況有關，不同菌株在不同生長狀況下產物積累量存在差異。

2.2 紫黃質和新黃質工程菌株的構建

以產玉米黃質的菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ為宿主菌株，轉入pACYCDuet-1-ZEP3質粒，構建產紫黃質菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-ZEP3。但HPLC檢測結果顯示并無紫黃質產生。分析原因可能為ZEP3基因來源于三角褐指藻，是真核生物來源的基因，可能存在信號肽或葉綠體轉運肽的編碼區(qū)，但原核生物無法實現(xiàn)真核生物對蛋白的加工，導致蛋白折疊錯誤，使活性減弱甚至消失。

因此利用網站http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/預測葉綠體轉運肽，預測前54個氨基酸為cTP區(qū)域。去除ZEP3基因的cTP后得到QZEP3，重新構建pACYCDuet-1-QZEP3質粒再轉入產玉米黃質的工程菌中，HPLC分析菌體內產物有紫黃質存在 (圖4)，進一步證實了以上猜想。

圖4 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3工程菌發(fā)酵產物HPLC結果Fig. 4 HPLC results of fermentation products of E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3

根據(jù)標準曲線及細胞干質量計算出產物濃度，E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3的紫黃質的產量為114.70 μg·g-1, 玉米黃質產量為289.45 μg·g-1。該工程菌中不僅有紫黃質生成，還有β-胡蘿卜素和玉米黃質中間產物的積累，但并未檢測到番茄紅素的積累，可能原因是QZEP3的蛋白水平并不高，使得玉米黃質有較多積累，而番茄紅素和β-胡蘿卜素的積累可能與菌株生長狀況相關，在不同生長狀況下產物積累量存在差異，致使菌體內存在中間產物的積累。進一步分析HPLC結果，該工程菌不僅產出預期的β-胡蘿卜素、玉米黃質和紫黃質，還有未知的產物 (保留時間6.2和10.6 min) 被檢測到，猜測可能是QZEP3催化玉米黃質生成紫黃質時還生成了中間體產物。

以產紫黃質的菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3為宿主菌株，轉入pACYCDuet-1-QZEP3-NSY質粒，構建產新黃質菌株E. coli BL21 NEO。用C30和C18色譜柱的方法對E. coli BL21 NEO菌體內產物進行檢測 (圖5)。紫黃質與新黃質是同分異構體，分子式為C40H56O4，分子量為600.417 9。E. coli BL21 NEO中的新黃質和紫黃質質譜結果 (圖6) 顯示，新黃質對應分子離子峰的m/z為600.414 6，紫黃質對應分子離子峰的m/z為600.413 8，這與紫黃質和新黃質分子量基本相當。HPLC與MS結果表明E. coli BL21 NEO成功產出新黃質。根據(jù)標準曲線及細胞干質量計算出各產物濃度，其中新黃質的產量為99.27 μg·g-1，紫黃質的產量為150.30 μg·g-1，玉米黃質的產量為119.77 μg·g-1。E. coli BL21 NEO 不僅產出預期的新黃質，還有β-胡蘿卜素、玉米黃質和紫黃質的積累，也有未知的中間體產物生成。

圖5 E. coli BL21 NEO工程菌HPLC檢測結果Fig. 5 Detection of E. coli BL21 NEO by HPLC

圖6 E. coli BL21 NEO工程菌新黃質 (a) 和紫黃質 (b) 的質譜檢測結果Fig. 6 Detection results of neoxanthin (a) and violaxanthin (b) in E. coli BL21 NEO by MS

本文以產玉米黃質的工程菌為宿主，并將QZEP3和NSY導入，實現(xiàn)了新黃質的合成，但是QZEP3和NSY基因導入后的紫黃質和新黃質產量濃度不高，可能是上游途徑的底物含量少，酶的催化效果不高，后續(xù)可以通過理性設計或定向進化對QZEP3和NSY進行改造，提高QZEP3和NSY在大腸桿菌中的活性來提高紫黃質和新黃質的產量，或者通過更換啟動子，調節(jié)MEP上游通路途徑，基因的過表達等方法[26-29]，進一步提升紫黃質和新黃質的產量。

3 結論

本文以大腸桿菌為表達菌株，進行了新黃質合成途徑的構建。以含有crtEBIYZ基因的產玉米黃質的E. coli BL21為宿主，引入了QZEP3和NSY基因，成功在大腸桿菌中建立了新黃質合成途徑。有關新黃質本身的生理活性研究并不多[30-32]，以微生物生產新黃質可提供新的生產途徑，為研究新黃質的生理活性等提供便利，也為進一步探究巖藻黃質的合成途徑奠定了基礎。巖藻黃質的合成途徑可以指導褐藻等海藻中巖藻黃質等物質的高值化利用，如通過理性設計改造獲得高產巖藻黃質的藻類。