趙雯宇,余達威,董俊麗,夏文水,李立華
1. 江南大學 食品學院/食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 無錫 214122
2. 暨南大學 材料科學與工程系/人工器官及材料教育部工程研究中心,廣東 廣州 511486
中國是淡水魚類養(yǎng)殖與消費大國。據(jù)統(tǒng)計,2019年中國淡水魚類年產(chǎn)量已超2 500萬噸[1],是國內(nèi)消費者攝入優(yōu)質(zhì)蛋白的極佳來源。以往國內(nèi)淡水魚以鮮活銷售為主,隨著生活節(jié)奏的加快和移動消費的興起,預制菜肴線上消費模式逐漸普及,促進了淡水魚消費從傳統(tǒng)的鮮活售賣向多元化、便利化方向轉(zhuǎn)變。調(diào)研發(fā)現(xiàn),生鮮魚片產(chǎn)品在盒馬鮮生、叮咚買菜等平臺均有銷售,尤其是疫情發(fā)生以來其受歡迎度明顯增加。然而,易腐敗、難保鮮、高損耗是生鮮淡水魚制品在銷售中面臨的首要問題。魚肉水分含量高,富含營養(yǎng)成分且pH呈中性,是微生物繁殖的極佳介質(zhì),同時魚宰后被激活的內(nèi)源蛋白酶系會加速魚肉質(zhì)地軟化與品質(zhì)劣變,最終失去食用價值[2]。貨架期短的特征給此類產(chǎn)品的運輸與銷售帶來極大挑戰(zhàn)。因此,通過保鮮手段提高此類產(chǎn)品的貯運品質(zhì),對促進該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
可食性涂膜技術(shù)被認為是一種綠色環(huán)保、有前景的食品保鮮方法。常用的涂膜保鮮基料包括多糖類、蛋白類和脂類。其中,甲殼素是地球上數(shù)量僅次于纖維素的第二大天然高分子,其脫乙酰化后的產(chǎn)物殼聚糖因自身具有抗菌性、成膜性、生物兼容性等優(yōu)點成為易腐食材涂膜保鮮研究中的常用材料[3]。當前研究主要集中于不同濃度殼聚糖涂膜[4-5]或殼聚糖基復合涂膜[6-7]對魚片的保鮮作用,大量研究已證實,殼聚糖基涂膜對生鮮魚肉的品質(zhì)保持有積極作用,被涂膜產(chǎn)品的貨架期較對照組顯著延長[8]。也有研究關(guān)注到殼聚糖分子量的差異性對自身功能活性有較大影響[9],例如Chang等[10]發(fā)現(xiàn)食源性腐敗菌對不同分子量殼聚糖的敏感性不同。因此,可以推斷殼聚糖涂膜處理對食品的保鮮效果可能與其分子量直接相關(guān)。目前,相關(guān)的支持性研究已在部分果蔬保鮮中得到印證[11-12],但其對魚肉的保鮮效果是否存在差異性及其影響程度尚待進一步研究。為此,筆者開展了3種分子量 (50、200和500 kD) 殼聚糖涂膜對冷藏草魚 (Ctenopharyngodon idella) 魚片品質(zhì)的保持效果研究,通過比較不同處理組樣品貯藏期間的感官品質(zhì)、微生物與理化指標,分析了不同分子量殼聚糖涂膜效果的差異性,為后續(xù)涂膜體系的優(yōu)化構(gòu)建和實際應用提供參考。
1.1.1 原料魚
鮮活草魚購于江蘇無錫歐尚超市,平均體質(zhì)量為 (2.0 ± 0.2) kg。草魚放血后去除魚鱗、魚鰓和內(nèi)臟。魚體用自來水沖洗干凈,用碎冰覆蓋,20 min后運到實驗室備用。
1.1.2 主要試劑
平均分子量為50、200和500 kD的食用級殼聚糖粉末 (脫乙酰度≥80%,濟南海得貝海洋生物工程有限公司),三氯乙酸 (TCA)、鹽酸、硼酸、乙腈、高氯酸、乙酸、丙酸等 (國藥集團化學試劑有限公司),生物胺標準品 (Sigma-Aldrich公司)。平板計數(shù)瓊脂、假單胞菌(Pseudomonas) CFC選擇性瓊脂 (青島海博生物技術(shù)有限公司)。
1.1.3 主要設備
UV-1000紫外可見分光光度計 (上海天美科學儀器有限公司);4K15高速冷凍離心機 (德國Sigma公司);EL-20 pH計 (上海Mettler Toledo儀器有限公司);KDN-103F蒸餾器 (上海纖檢儀器有限公司);Waters 1525高效液相系統(tǒng)-PDA檢測器 (美國Waters公司);TA.XTP Plus物性分析儀 (英國Stable Micro System公司);T10高速分散機(德國IKA公司);恒溫恒濕箱 (上海一恒儀器有限公司);BCD-610WkM冰箱 (美的集團股份有限公司)。
不同分子量殼聚糖 (50、200和500 kD) 按1.25%的添加量分別溶于體積分數(shù)為1%的乙酸-丙酸等體積混合酸溶液中,添加質(zhì)量分數(shù)為25%的甘油(殼聚糖) 作為塑化劑,混合溶液磁力攪拌4 h至殼聚糖完全溶解制備成涂膜液。
魚背部肌肉切成約4 cm×3 cm×1.5 cm魚塊,用預冷無菌蒸餾水沖洗瀝干后備用。將瀝干魚塊分成4組,其中3組魚塊分別浸泡于不同殼聚糖酸溶液中 (分別標記為50 kD-CH、200 kD-CH和500 kD-CH),1組魚塊浸泡于去離子水中 (對照組),魚塊與浸漬液的質(zhì)量體積比約為1∶3。參考Zhao等[13]方法并做適當修改,施加真空滲透輔助處理,即在10 kPa真空壓力下浸泡5 min并在5 s內(nèi)恢復常壓后繼續(xù)浸漬5 min。取出魚片置于鏤空鐵絲網(wǎng)盤上放入4 ℃無菌恒溫恒濕箱,用濾紙吸去魚肉底部匯聚的涂膜液繼續(xù)瀝干30 min。最后,魚片用無菌蒸煮袋單獨包裝,于4 ℃冰箱貯藏。涂膜組和空白組樣品在第2、第4、第6和第8天取樣,測定微生物和相關(guān)理化指標。未浸泡處理的魚片也作取樣分析,作為第0天樣品。
1.3.1 感官評價
由9人 (4男5女,22~42歲) 組成感官評定小組。參考Khazandi等[14]方法,采用5分制對魚片的質(zhì)地、氣味和色澤進行評分。感官評分標準見表1,感官評分經(jīng)3項指標得分權(quán)重計算獲得,感官評分=(2×氣味+2×色澤+1×質(zhì)地)/5。最高5分,最低1分,其中剛宰殺后獲得的魚片感官評分被定為5分,感官評分<3分時則認為魚片品質(zhì)是不可接受水平。
表1 感官評分標準Table 1 Criterion for sensory evaluation
1.3.2 微生物計數(shù)
采用平板傾注法計數(shù),菌落總數(shù) (Total viable count, TVC)和假單胞菌數(shù)分別在30、37 ℃條件下培養(yǎng)2 d后計數(shù),微生物計數(shù)單位為log10CFU·g-1。
1.3.3 剪切力
用TA.XTP Plus物性分析儀測定魚肉剪切力,探頭型號A/CKB,觸發(fā)力5 g,剪切程度50%,測試速度為 1 mm·s-1。
1.3.4 汁液流失率
通過比較魚片在貯藏一段時間后質(zhì)量變化計算得到汁液流失率 (%)。汁液流失率=(初始質(zhì)量-貯藏后質(zhì)量)/初始質(zhì)量×100%。
1.3.5 pH
稱取5 g魚肉,加入20 mL預冷去離子水,用T10分散機均質(zhì)1 min,離心 (2 000×g, 5 min)后所得的上清液測pH。
1.3.6 揮發(fā)性鹽基氮 (TVB-N)
參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法進行測定,單位為mg·(100 g)-1。
1.3.7 TCA-溶解肽
參考Li等[15]方法,取3 g攪碎樣加入27 mL預冷的質(zhì)量濃度為50 mg·mL-1的TCA溶液,均質(zhì)2 min,離心取上清液 (10 000×g, 4 ℃, 10 min)。上清液中TCA-可溶性肽采用Lorry法測定,單位為μmol·g-1。
1.3.8 生物胺
魚肉中生物胺提取、柱前衍生及HPLC含量測定等程序參考Yu等[16],魚肉中的生物胺通過與標準品峰面積比較得到,單位為mg·kg-1。
剪切力指標進行8次重復測試,取4個中間值作為有效值;其他指標進行3次重復測試。采用SPSS 19.0、Excel 2016和Origin 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析和作圖,通過Duncan's進行顯著性分析(P<0.05)。
貯藏期間,不同組樣品的感官評分均呈逐漸下降趨勢 (圖1)。貯藏第2天,各組的感官評分介于4.6~4.7,且組間無顯著性差異 (P>0.05),表明貯藏前2 d各組魚片均保持良好的食用品質(zhì)。從貯藏第2天起,對照組的感官評分呈現(xiàn)快速下降趨勢,第6天其感官評分急速下降至2.51,與其他組差異明顯 (P<0.05),低于可接受標準的最低限值,此時魚片表現(xiàn)出輕微腥臭味、部分表面色澤發(fā)黃且質(zhì)地彈性不足;第8天魚片有明顯惡臭味,腐敗現(xiàn)象嚴重;表明對照組魚片的貨架期少于6 d,與Sun等[17]報道的未處理冷藏草魚塊的貨架期接近。相比之下,涂膜組的感官評分從貯藏第2天起顯著高于對照組(P<0.05);第6天,50 kD-CH、200 kD-CH和500 kDCH組的感官評分分別為3.46、3.82和3.68,遠高于可接受標準的最低限值,表明3種分子量殼聚糖涂膜均有利于延長冷藏魚片的貨架期。魚肉感官品質(zhì)劣變主要由微生物、內(nèi)源酶及氧化誘導的生化反應所致。相比于對照組,殼聚糖涂膜處理可抑制魚片感官品質(zhì)劣變,這與殼聚糖的抗菌和抗氧化活性密切相關(guān),從而抑制了生物胺、揮發(fā)性醛類等不良代謝產(chǎn)物的積累。在貯藏第2至第6天,200 kDCH組的感官評分最高,但與50 kD-CH和500 kDCH兩組無顯著性差異(P>0.05),而到第8天僅200 kD-CH組的感官評分>3,一定程度上表明200 kD殼聚糖對魚片保鮮作用的持續(xù)性效果優(yōu)于另兩種殼聚糖。
圖1 不同分子量殼聚糖涂膜對冷藏魚片感官品質(zhì)的影響Fig. 1 Effect of different molecular weight chitosan coatings on sensory quality of fillets during refrigerated storage
微生物活動是引起貯藏魚肉品質(zhì)變化的關(guān)鍵因素,其增殖行為可反映水產(chǎn)品的腐敗程度。各組樣品貯藏期間TVC和假單胞菌計數(shù)變化見表2,新鮮草魚片TVC為4.33 log10CFU·g-1,與Huang等[18]報道的草魚片初始菌數(shù)相近。相比于起始值,各涂膜組TVC在貯藏第2天下降了0.08~0.29 log10CFU·g-1,表明涂膜處理能減少魚片表面附著的微生物數(shù)量。在貯藏前4 d,對照組和涂膜組TVC增速緩慢,但之后急速增加。對照組TVC在貯藏第6天時達到8.39 log10CFU·g-1,超過國際食品微生物規(guī)范委員會 (ICMSF) 的推薦標準 (≤7 log10CFU·g-1)[19],魚片品質(zhì)已不可接受,與貨架期的感官評價一致。相比之下,涂膜組對應的TVC較對照組顯著減少了1.42~2.06 log10CFU·g-1(P<0.05)。由此可以認為,殼聚糖涂膜對魚片有良好的抑菌效果,這與殼聚糖涂膜保鮮大黃魚 (Pseudosciaena crocea)[4]和美國紅魚 (Sciaenops ocellatus)[5]的結(jié)果相似。殼聚糖的抑菌性與其陽離子特性有關(guān),通過與細胞成分相互作用影響了微生物完整性和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[20]。200 kDCH組在貯藏4~8 d期間TVC最低,表明200 kD殼聚糖在抑菌方面總體優(yōu)勢最佳。Hosseinnejad和Jafari[21]指出殼聚糖抑菌性與其分子量密切相關(guān),總結(jié)了不同分子量殼聚糖差異性的抑菌機制,這部分解釋了本研究中3種殼聚糖抑菌表現(xiàn)不同的原因。
表2 不同分子量殼聚糖涂膜對冷藏魚片微生物計數(shù)的影響Table 2 Effect of different molecular weight chitosan coatings on microbial enumeration of fillets during refrigerated storagelog10 CFU·g-1
假單胞菌是冷藏魚制品的特征腐敗菌,是產(chǎn)生揮發(fā)性含氮物質(zhì)的主要貢獻者[22]。本研究中,對照組與涂膜組假單胞菌分別在貯藏第2和第4天首次被檢測到 (表2)。各組假單胞菌數(shù)隨著貯藏時間的延長持續(xù)增加,到第8天時對照組、50 kD-CH、200 kD-CH、500 kD-CH組分別達到6.23、5.03、4.48、4.80 log10CFU·g-1。殼聚糖對腐敗菌的抑制效果是涂膜魚片品質(zhì)劣變程度減緩的重要原因,魚片在貯藏后期的感官品質(zhì)顯著優(yōu)于對照組,其中200 kD-CH組從貯藏第6天起假單胞菌計數(shù)最低,表明其對假單胞菌的抑菌效果優(yōu)于另兩種殼聚糖。
貯藏期間,不同分子量殼聚糖涂膜的草魚片pH變化呈先下降后上升的趨勢 (圖2-a)。對照組魚片在貯藏第2天pH降到最低,之后迅速增加,并在第6天超過7。這與魚宰殺后肌肉發(fā)生僵直和自溶有關(guān),在此期間通過無氧糖酵解反應產(chǎn)生的乳酸和ATP導致魚肉pH降低;隨后pH逐漸升高,是由于微生物代謝活動使堿性含氮物質(zhì)積累所致[2]。另外,3個涂膜組魚片pH在貯藏前期降低程度大于對照組,這與殼聚糖溶液弱酸性的本質(zhì)有關(guān)。從貯藏第4天起,涂膜組魚片pH總體呈現(xiàn)緩慢上升的變化趨勢,但增加不明顯且組間無顯著性差異 (P>0.05)。與對照組相比,涂膜組貯藏終點pH降低超0.3,表明涂膜組魚片中堿性含氮物含量低于對照組。
與pH的變化趨勢不同,各組魚片TVB-N在貯藏期間持續(xù)增加 (圖2-b)。新鮮樣品起始TVBN為6.67 mg·(100 g)-1;到貯藏第8天,對照組的TVB-N達到14.04 mg·(100 g)-1,為起始值的2倍多。相比之下,涂膜組TVB-N的積累速度明顯減緩。從貯藏第2天起,涂膜組的TVB-N顯著低于對照組(P<0.05),表明殼聚糖涂膜處理能有效抑制魚片TVB-N積累,這與殼聚糖對腐敗菌的抑制效果直接相關(guān),如假單胞菌、希瓦氏菌 (Shewanella)等[22]。根據(jù)Yu等[23]推薦的腐敗草魚TVB-N閾值[12~15 mg·(100 g)-1],對照組樣品在貯藏第6天時已達12.32 mg·(100 g)-1,超過推薦標準最低值,50 kD-CH和500 kD-CH組魚肉均在第8天超過該推薦值,而200 kD-CH組在第8天TVB-N為11.17 mg·(100 g)-1,較對照組減少了20%以上。200 kD殼聚糖涂膜處理對魚片TVB-N的抑制效果更佳,與微生物計數(shù)結(jié)果相吻合。
圖2 不同分子量殼聚糖涂膜對冷藏魚片pH和揮發(fā)性鹽基氮的影響Fig. 2 Effect of different molecular weight chitosan coatings on pH and TVB-N of fillets during refrigerated storage
TCA-溶解肽是反映魚肉貯藏過程中蛋白質(zhì)降解程度的重要指標。與TVB-N的變化趨勢一致,本研究中4組魚片TCA-溶解肽含量均隨貯藏時間的延長呈持續(xù)增加的趨勢 (圖3),顯示貯藏期間各組魚片持續(xù)發(fā)生了蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象,微生物代謝活動可能是引起TCA-溶解肽增加的重要因素。對照組的TCA-溶解肽質(zhì)量摩爾濃度在貯藏前2 d增速較快,達到1.21 μmol·g-1,較新鮮樣品初始值增長近25%,之后持續(xù)緩慢增加。涂膜組的TCA-溶解肽水平從貯藏第2天起低于對照組,一定程度上反映了殼聚糖涂膜處理可抑制蛋白質(zhì)降解,但3個涂膜組的TCA-溶解肽值在各取樣點無顯著性差異 (P>0.05)。
圖3 不同分子量殼聚糖涂膜對冷藏魚片TCA-溶解肽的影響Fig. 3 Effect of different molecular weight chitosan coatings on TCA-soluble peptides of fillets during refrigerated storage
魚肉質(zhì)構(gòu)特性是反映產(chǎn)品物理品質(zhì)的重要參數(shù),直接影響消費者對魚肉的可接受程度[24]。在貯藏期間不同處理組魚片的剪切力強度持續(xù)下降,各組魚片質(zhì)構(gòu)變化主要發(fā)生在貯藏前4 d (圖4),對照組、50 kD-CH、200 kD-CH、500 kD-CH組剪切力較起始值分別減少了57.8%、48.6%、37.0%、45.2%。之后各組剪切力值下降趨于平緩。從貯藏第4天起,涂膜組魚片剪切力較對照組增加了20%以上,表明涂膜處理對魚肉質(zhì)構(gòu)特性起到積極的保護作用,其中200 kD殼聚糖處理的保護作用最佳,其貯藏第8天的剪切力為對照組的2.27倍,而50 kD殼聚糖處理的保護作用在3個涂膜組中最差。魚肉貯藏前期的質(zhì)構(gòu)劣變與內(nèi)源酶誘導的結(jié)構(gòu)蛋白水解緊密相關(guān)[25-26]。貯藏期間涂膜組剪切力值顯著高于對照組 (P<0.05),在某種程度上可推測是殼聚糖涂膜處理對內(nèi)源酶起到調(diào)控作用,該涂膜通過氧氣阻隔與脂質(zhì)氧化抑制減少魚肉中活性氧積累,從而減緩細胞凋亡發(fā)生及后續(xù)內(nèi)源蛋白酶激活級聯(lián)反應,最終表現(xiàn)為內(nèi)源酶活性減弱[27]。
圖4 不同分子量殼聚糖涂膜對冷藏魚片剪切力的影響Fig. 4 Effect of different molecular weight chitosan coatings on shear force of fillets during refrigerated storage
貯藏期間,各組樣品汁液流失率的變化與剪切力相反,呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢 (圖5),4組魚片的汁液流失率在前2 d均<2%,且組間無顯著性差異(P>0.05)。隨著貯藏時間的增加,對照組汁液流失率增速快于涂膜組。貯藏8 d后,50 kD-CH、200 kD-CH和500 kD-CH組的汁液流失率分別為對照組的90.7%、75.3%和80.5%。魚肉汁液流失主要與水分蒸發(fā)以及蛋白質(zhì)變化等導致的肌肉持水能力下降有關(guān),涂膜處理減少魚片汁液流失的主要原因可能是殼聚糖涂膜層有較好的保水能力;此外,涂膜處理也可能通過抑制結(jié)構(gòu)蛋白降解,提高魚肉的持水能力[28],這與剪切力的變化可相互印證。本研究顯示,200 kD殼聚糖處理對汁液流失的抑制效果略好于另外兩組涂膜處理,但各組之間的差異不明顯。
圖5 不同分子量殼聚糖涂膜對冷藏魚片汁液流失率的影響Fig. 5 Effect of different molecular weight chitosan coatings on drip loss of fillets during refrigerated storage
腐胺、尸胺、組胺是冷藏水產(chǎn)品特征性腐敗生物胺,可作為魚肉品質(zhì)變化的參考性評價指標[29]。新鮮魚肉的腐胺、尸胺、組胺和酪胺質(zhì)量分數(shù)分別為 4.77、0.15、1.26和 6.82 mg·kg-1。貯藏期間對照組的組胺和酪胺質(zhì)量分數(shù)顯著增加 (P<0.05),到第8天時質(zhì)量分數(shù)分別達到64.2和58.90 mg·kg-1,成為4種生物胺中的主要成分(表3)。相比之下,涂膜處理能顯著抑制組胺與酪胺積累,其質(zhì)量分數(shù)分別為對照組的3.2%~12.5%和34.6%~71.1%,其中涂膜組的組胺質(zhì)量分數(shù)無顯著性差異;500 kD殼聚糖涂膜處理對抑制酪胺積累的效果最佳,其次為50 kD-CH、200 kD-CH組。對照組腐胺在貯藏0~6 d期間無顯著變化,在第8天時質(zhì)量分數(shù)達到20.5 mg·kg-1;涂膜組腐胺在貯藏前6 d總體低于對照組,但無顯著性差異(P>0.05);到第8天時,50 kD-CH、200 kD-CH和500 kD-CH組腐胺質(zhì)量分數(shù)分別為對照組的58.1%、35.2%和69.1%。對照組尸胺質(zhì)量分數(shù)在貯藏前4 d增量低于涂膜組,但之后積累速度顯著提高,從第4天的0.26 mg·kg-1迅速增加到第8天的18.60 mg·kg-1。與此同時,涂膜組尸胺質(zhì)量分數(shù)從第6天顯著低于對照組,到第8天時僅為對照組的17.2%~23.4%,但整個貯藏期間3組涂膜組的尸胺質(zhì)量分數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。從表3可以看出,殼聚糖涂膜處理可有效抑制生物胺積累,這取決于殼聚糖的抑菌性 (表2)。已有研究證實冷藏草魚特征腐敗菌 (如假單胞菌、希瓦氏菌等) 是魚肉冷藏過程中生物胺的主要生產(chǎn)者[30]。此外,不同殼聚糖涂膜處理對生物胺的抑制效果也呈現(xiàn)差異性。到貯藏期末,200 kD殼聚糖處理對腐胺的抑制效果最佳,而50 kD和500 kD殼聚糖則更有利于抑制酪胺積累。
表3 不同分子量殼聚糖涂膜對冷藏魚片生物胺質(zhì)量分數(shù)的影響Table 3 Effect of different molecular weight chitosan coatings on mass fraction of biogenic amine of fillets during refrigerated storage mg·kg-1
本研究選取的殼聚糖分子量基本覆蓋了近年來有關(guān)食品涂膜保鮮報道文獻所用的殼聚糖。本研究證實50、200、500 kD殼聚糖均能抑制微生物擴增、含氮物積累及質(zhì)構(gòu)劣化,使冷藏魚片品質(zhì)得到有效保持。結(jié)合TVC、TVB-N和感官評價分析,3種殼聚糖涂膜均能延長魚片貨架期 2 d以上,其中200 kD殼聚糖涂膜處理對魚片貨架期的延長效果更為明顯。通過對比3種殼聚糖涂膜對冷藏草魚片的保鮮效果,200 kD殼聚糖涂膜在魚片感官評分、微生物計數(shù)、TVB-N、剪切力、汁液流失率等指標上有更佳表現(xiàn)。貯藏第8天時,200 kD-CH組魚片TVC和假單胞菌數(shù)較對照組分別減少了1.10和1.75 log10CFU·g-1,TVB-N、汁液流失率、腐胺質(zhì)量分數(shù)較對照組分別減少了20.5%、24.7%和64.8%,剪切力提高了1.26倍,200 kD分子量的殼聚糖可作為優(yōu)先選擇的涂膜保鮮基料。