吳燕燕，王悅齊，沈穎瑩, ，陳 茜, ，李春生，趙永強(qiáng)，楊少玲，潘 創(chuàng)，李來(lái)好

1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

2. 浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022

3. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306

近年來(lái)，發(fā)酵鱖魚(yú) (Siniperca chuatsi) 因獨(dú)特風(fēng)味和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到了消費(fèi)者的青睞，市場(chǎng)需求不斷增加。隨著民眾對(duì)食品安全認(rèn)知的不斷加深，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)要求也越來(lái)越高，但當(dāng)前發(fā)酵鱖魚(yú)的加工方式仍以經(jīng)驗(yàn)式的自然發(fā)酵方式為主，產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)不穩(wěn)定且發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)[1-3]。接種發(fā)酵劑是探索穩(wěn)定發(fā)酵食品品質(zhì)的一種新途徑，不僅可提升發(fā)酵產(chǎn)品的感官品質(zhì)，還能較好地改善發(fā)酵產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分、風(fēng)味、質(zhì)地等。Wen等[4]發(fā)現(xiàn)接種乳酸菌可減少發(fā)酵牛肉脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化程度，其中嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus) 可改善產(chǎn)品風(fēng)味；石建喜等[5]在鰱 (Hypophthalmichthys molitrix) 中接種由植物乳桿菌(L. plantarum)、木糖葡萄球菌 (Staphylococcus xylosus) 和釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 配制成的復(fù)合發(fā)酵劑，鰱的pH明顯下降，有效抑制了腸桿菌和假單胞菌等有害微生物的生長(zhǎng)。目前發(fā)酵劑的選擇與制備已成為改善發(fā)酵食品品質(zhì)的重要研究方向。選擇合適的發(fā)酵劑不僅可滿足食品發(fā)酵的生產(chǎn)需求，也是有效改善發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味、品質(zhì)的重要手段。乳酸菌和葡萄球菌均是當(dāng)前熱門(mén)的微生物發(fā)酵劑，對(duì)發(fā)酵魚(yú)制品品質(zhì)提升有重要影響。Han等[6]分別接種植物乳桿菌和乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis) 到魚(yú)茶中，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)產(chǎn)品發(fā)酵、增強(qiáng)風(fēng)味、提高產(chǎn)品安全性。

發(fā)酵食品的工藝條件對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)改變有重要影響，工藝條件包括溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種配比、菌種添加量、輔料添加量和環(huán)境濕度等。張大為等[7]優(yōu)化了發(fā)酵酸魚(yú)工藝中食鹽和玉米的添加量、發(fā)酵溫度和時(shí)間，提升了酸魚(yú)品質(zhì)。復(fù)合菌種發(fā)酵劑的發(fā)酵效果要優(yōu)于單一菌，使產(chǎn)品保持良好的色澤、風(fēng)味與安全性。張瀟等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)接種植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和釀酒酵母發(fā)酵的鲊魚(yú)，相比自然發(fā)酵產(chǎn)品，其對(duì)抑制有害菌的生長(zhǎng)和生物胺的形成效果最佳，也使產(chǎn)品有較好的風(fēng)味和感官品質(zhì)。

本項(xiàng)目組在前期實(shí)驗(yàn)中將多種發(fā)酵微生物用于鱖魚(yú)發(fā)酵研究，在研究單個(gè)發(fā)酵微生物發(fā)酵特性的基礎(chǔ)上，探索了添加單菌發(fā)酵與多菌進(jìn)行混菌發(fā)酵應(yīng)用的可能性，最終篩選出戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、清酒乳桿菌(L. sakei)與肉葡萄球菌(S. carnosus)復(fù)配用于鱖魚(yú)發(fā)酵，可得到品質(zhì)較好的發(fā)酵鱖魚(yú)產(chǎn)品[9]。在此基礎(chǔ)上，本研究開(kāi)展了混菌接種發(fā)酵鱖魚(yú)的工藝優(yōu)化與品質(zhì)分析，為后續(xù)發(fā)酵鱖魚(yú)新工藝的建立和復(fù)合發(fā)酵劑的研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

材料：新鮮鱖魚(yú)，單尾體質(zhì)量約500 g，購(gòu)于廣東省佛山市三水區(qū)樂(lè)平鎮(zhèn)三江村；食鹽、花椒、辣椒、生姜、茴香、八角等購(gòu)于廣東省廣州市華潤(rùn)萬(wàn)家超市；戊糖片球菌、清酒乳桿菌，實(shí)驗(yàn)所用菌種濃度為108CFU·g-1，購(gòu)于西安天象生物工程有限公司；肉葡萄球菌 (ATCC 51365, DSM 20501) 為凍干粉，實(shí)驗(yàn)所用菌種濃度為108CFU·mL-1，購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心；自然發(fā)酵鱖魚(yú) (發(fā)酵周期為11 d) 由安徽當(dāng)?shù)仄髽I(yè)提供。

試劑：氯化鉀、甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液、三氯乙酸、乙二胺四乙酸 (EDTA)、2-硫代巴比妥酸、氯仿、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、高氯酸等，購(gòu)于北京依珊匯通科技有限公司。

儀器：HSP-460BE恒溫恒濕培養(yǎng)箱和立式蒸汽滅菌鍋 (上海力辰邦西儀器科技有限公司)；雷磁PHS-25 pH計(jì) (上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；LFRA-100質(zhì)構(gòu)儀 (美國(guó)Brookfield公司)；809 Titrando自動(dòng)電位滴定儀 (瑞士萬(wàn)通公司)；KjeltecTM 2300蛋白自動(dòng)分析儀 (丹麥福斯分析儀器公司)；Sunrise-basic TacanSUNRISE吸光酶標(biāo)儀 (瑞士TECAN公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

1) 原料魚(yú)處理：新鮮鱖魚(yú)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，立即分裝并于 —80 ℃凍存，后續(xù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量取樣，以避免新鮮度下降。

2) 接種發(fā)酵鱖魚(yú)樣品制備：以優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進(jìn)行制備。

3) 傳統(tǒng)自然發(fā)酵鱖魚(yú)樣品制備：以傳統(tǒng)方法進(jìn)行制備 (秋季)，發(fā)酵時(shí)間為11 d。

4) 品質(zhì)分析樣品處理：分別取接種發(fā)酵鱖魚(yú)和自然發(fā)酵鱖魚(yú)樣品，低溫緩慢解凍后，取其背部肌肉，絞碎后混合均勻，-18 ℃下凍藏備用。

1.2.2 工藝流程及要點(diǎn)

1) 工藝流程：冷凍鱖魚(yú)→低溫解凍→去鱗、鰓和內(nèi)臟→添加食鹽、香辛料、發(fā)酵劑→混合均勻→加壓→恒溫發(fā)酵→發(fā)酵成熟→包裝→-18 ℃凍藏。

2) 工藝要點(diǎn)：選擇單尾體質(zhì)量約500 g的冷凍鱖魚(yú)低溫緩慢解凍，再去其鱗、鰓和內(nèi)臟，用清水將魚(yú)體沖洗干凈；處理后的鱖魚(yú)平鋪在發(fā)酵箱內(nèi)，添加菌、食鹽和香辛料 (香辛料質(zhì)量分?jǐn)?shù)：花椒粉0.06%，辣椒粉0.06%，生姜0.04%，茴香0.02%，八角0.01%等)，使其均勻覆蓋于魚(yú)體表面和腹內(nèi)；選用規(guī)則的重物置于魚(yú)體表面加壓，恒溫恒濕發(fā)酵；每隔1 d翻動(dòng)魚(yú)身，使發(fā)酵液以及香辛料均勻分布至魚(yú)體各處，直至發(fā)酵成熟后用食品級(jí)密封袋包裝，于-18 ℃下凍藏。其中實(shí)驗(yàn)組在加工過(guò)程中接種混菌，按設(shè)計(jì)發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵；傳統(tǒng)自然發(fā)酵鱖魚(yú)在加工過(guò)程中不接種菌 ，發(fā)酵時(shí)間為11 d。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1) 菌種配比對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)的影響：分別對(duì)鱖魚(yú)接種不同比例的混菌[m(戊糖片球菌)∶m(清酒乳桿菌)∶m(肉葡萄球菌)分別為1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3、1∶2∶1、1∶2∶2]，接種量均為1%，食鹽添加量為4%，25 ℃下發(fā)酵3 d后，取魚(yú)肉測(cè)定其彈性并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

2) 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)的影響：分別在15、20、25、30、35 ℃下發(fā)酵鱖魚(yú)，菌種配比均為m(戊糖片球菌)∶m(清酒乳桿菌)∶m(肉葡萄球菌)=1∶1∶1，接種量為1%，食鹽添加量為4%，發(fā)酵3 d后取魚(yú)肉測(cè)定其彈性并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

3) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)的影響：鱖魚(yú)分別發(fā)酵2、3、4、5、6 d，菌種配比均為m(戊糖片球菌)∶m(清酒乳桿菌)∶m(肉葡萄球菌)=1∶1∶1，接種量為1%，食鹽添加量為4%，發(fā)酵溫度為25 ℃，待發(fā)酵完成后取魚(yú)肉測(cè)定其彈性并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

4) 混菌接種量對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)的影響：分別在鱖魚(yú)中加入混菌，其接種量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，菌種配比為m(戊糖片球菌)∶m(清酒乳桿菌)∶m(肉葡萄球菌)=1∶1∶1，食鹽添加量為4%，在25 ℃下發(fā)酵3 d后取魚(yú)肉測(cè)定其彈性并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

1) 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理并建立模型，采用Design-Expert軟件以感官評(píng)分作為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)(表1)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)分析后確定出最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.5 感官評(píng)定

鱖魚(yú)發(fā)酵成熟的判斷依據(jù)是魚(yú)體表面散發(fā)淡臭味，而魚(yú)肉尚未發(fā)生明顯腐敗，肉質(zhì)仍較緊實(shí)，發(fā)酵箱內(nèi)有發(fā)酵液產(chǎn)生且不再明顯增加。 取發(fā)酵成熟的鱖魚(yú)背部中段魚(yú)肉蒸煮6 min。由8～10名具備感官評(píng)價(jià)基本知識(shí)的食品專業(yè)學(xué)生 (男女人數(shù)各一半，年齡介于24～28歲) 從產(chǎn)品色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)、滋味5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)并計(jì)算總分。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]見(jiàn)表2。

表2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria

1.2.6 理化指標(biāo)測(cè)定

1) 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定。取各魚(yú)體中段背部肌肉，分別修整為3 cm×2 cm×1 cm的方塊，蒸煮5 min，經(jīng)質(zhì)地多面剖析測(cè)試模式通過(guò)二次壓縮法測(cè)定其質(zhì)構(gòu)，其參數(shù)為：探頭為平底柱形探頭TA44，測(cè)試速率為0.5 mm·s-1，壓縮程度為50%，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5.0 g。每組至少平行測(cè)定3次，且每個(gè)魚(yú)塊選擇3個(gè)點(diǎn)各測(cè)量一次，去除異常值后求平均值。

2) 水分的測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》。

3) pH的測(cè)定參照GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測(cè)定》。

4) 氨基態(tài)氮和總酸的測(cè)定參照鄒大維等[11]的方法稍作修改：準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品于均質(zhì)杯中，加入25 mL 50 ℃的純凈水，均質(zhì)1 min (30 s×2次)后，加50 ℃的純凈水定容至50 mL；在50 ℃下水浴30 min，待冷卻至室溫后，用雙層濾紙過(guò)濾，取其濾液備用，采用電位滴定儀測(cè)定樣品中的氨基態(tài)氮和總酸含量。

5) 硫代巴比妥酸反應(yīng)值 (TBARS) 的測(cè)定參考GB 5009.181—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛的測(cè)定》。

6) 揮發(fā)性鹽基氮 (TVB-N) 的測(cè)定參照張婷等[12]的方法稍作修改：準(zhǔn)確稱取5.0 g 絞碎魚(yú)肉于均質(zhì)杯中，加入 45 mL 0.6 mol·L-1高氯酸溶液，均質(zhì) 2 min，4 ℃ 冰箱內(nèi)靜置 40 min 后，10 000 r·min-1離心10 min，取濾液，用自動(dòng)凱式定氮儀進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和SPSS 24.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 菌種配比的選擇

鱖魚(yú)經(jīng)發(fā)酵后質(zhì)地發(fā)生顯著變化，魚(yú)肉緊實(shí)彈滑，是其重要的感官評(píng)價(jià)特征和質(zhì)構(gòu)特性。彈性反映魚(yú)肉壓縮變性后能夠再?gòu)?fù)原的程度，這與發(fā)酵鱖魚(yú)的口感有密切關(guān)系。當(dāng)菌種配比 [m(戊糖片球菌)∶m(清酒乳桿菌)∶m(肉葡萄球菌)] 為 1∶1∶1、1∶1∶2和1∶1∶3時(shí)，發(fā)酵鱖魚(yú)的彈性略有增加，其中以1∶1∶3的彈性最好，口感柔軟有彈性，魚(yú)肉呈明顯蒜瓣肉特征 (圖1)；而菌種配比為1∶2∶1和1∶2∶2時(shí)，樣品的彈性呈下降趨勢(shì)，不同菌種配比下的彈性差異并不明顯?；炀星寰迫闂U菌的比例增加，產(chǎn)酸速率加快，導(dǎo)致魚(yú)肉pH快速下降，造成水分流失從而影響發(fā)酵鱖魚(yú)的彈性。此外，不同菌種配比的樣品間感官品質(zhì)差異明顯。當(dāng)菌種配比為1∶1∶3時(shí)，其各項(xiàng)感官指標(biāo)均較為突出，感官總分最高；而菌種配比為1∶2∶1和1∶2∶2 時(shí)，樣品的口感和滋味下降?？赏茢嗾J(rèn)為，清酒乳桿菌比例增加，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)過(guò)多，對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)的滋味產(chǎn)生不良影響[13]。綜合上述結(jié)果，選取菌種配比為1∶1∶3時(shí)為最優(yōu)組。

圖1 菌種配比對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)彈性和感官品質(zhì)的影響Fig. 1 Effects of strain ratio on elasticity and sensory quality of fermented S. chuatsi

2.1.2 發(fā)酵溫度的選擇

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)的彈性變化有重要影響，其彈性隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸下降 (圖2)。當(dāng)發(fā)酵溫度為15和20 ℃時(shí)，發(fā)酵鱖魚(yú)的彈性較好；而當(dāng)溫度為30和35 ℃時(shí)，其彈性顯著降低，適口性差。在感官品質(zhì)方面，15和20 ℃的樣品色澤和組織狀態(tài)較好；而在20與25 ℃下，樣品具有較好的發(fā)酵氣味、口感和滋味，可產(chǎn)生較為宜人的發(fā)酵鱖魚(yú)風(fēng)味。但30與35 ℃下樣品的感官評(píng)分顯著下降，這是由于高溫、低鹽發(fā)酵使魚(yú)肉脂肪過(guò)度氧化，導(dǎo)致魚(yú)肉色澤變差，產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)，從而影響了整體的氣味和滋味。此外，高溫條件發(fā)酵的魚(yú)肉肉質(zhì)松散，這與彈性的結(jié)果基本一致。綜合彈性與感官評(píng)價(jià)，發(fā)酵鱖魚(yú)的發(fā)酵溫度以20 ℃為宜。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)彈性和感官品質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of fermentation temperature on elasticity and sensory quality of fermented S. chuatsi

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的選擇

鱖魚(yú)肉的彈性隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，其中發(fā)酵2～4 d的樣品的彈性變化較小，而發(fā)酵5 d后樣品的彈性明顯下降 (圖3)。感官品質(zhì)呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)。發(fā)酵第2天，因發(fā)酵作用時(shí)間較短，發(fā)酵不明顯，發(fā)酵氣味極弱且?guī)в恤~(yú)腥味；發(fā)酵第3天，魚(yú)肉的發(fā)酵風(fēng)味開(kāi)始有所改善；發(fā)酵第4天，魚(yú)肉的發(fā)酵氣味適宜且滋味最佳，口感、滋味和組織狀態(tài)等均較好。發(fā)酵第5至第6天時(shí)，其感官品質(zhì)明顯下降，特別在第6天發(fā)酵氣味過(guò)濃且伴隨異味出現(xiàn)，口感、滋味等明顯下降，魚(yú)肉的蒜瓣?duì)罱M織特征不明顯。綜合彈性和感官評(píng)價(jià)，選擇4 d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)彈性和感官品質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on elasticity and sensory quality of fermented S. chuatsi

2.1.4 混菌接種量的選擇

混菌接種量的變化對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)彈性和感官品質(zhì)有一定的影響 (圖4)。改變接種量后，魚(yú)肉仍可保持較好的彈性且彼此間差異相對(duì)較小，其中接種量為1.0%時(shí)彈性最佳。在感官品質(zhì)方面，接種量為1.0%時(shí)，魚(yú)肉各感官指標(biāo)均較突出，總分最高；當(dāng)接種量為0.5%時(shí)，可能因接種量較少導(dǎo)致發(fā)酵作用較弱，發(fā)酵魚(yú)肉雖能保持較好的色澤，但滋味較差；當(dāng)接種量增加至1.5%，其色澤、滋味等下降較明顯，并隨著接種量的增加感官評(píng)分呈迅速下降的趨勢(shì)。因此，綜合彈性和感官評(píng)分，以1.0%為最佳的發(fā)酵劑接種量。

圖4 接種量對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)彈性和感官品質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of inoculation amount on elasticity and sensory quality of fermented S. chuatsi

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，菌種比例為1∶1∶3時(shí)，根據(jù)Box-Behnken程序設(shè)計(jì)發(fā)酵鱖魚(yú)發(fā)酵溫度為15、20、25 ℃，發(fā)酵時(shí)間為3、4、5 d，發(fā)酵劑接種量為0.5%、1.0%、1.5%的三因素三水平試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Box-Behnken test design and results

表4 感官評(píng)分回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of sensory score regression model

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，最終得到回歸模型方程為：S=84.44+3.25A-0.85B+0.45C-2.00AB+0.35AC-0.10BC-5.90A2-4.30B2-3.24C2，S表示感官。根據(jù)鱖魚(yú)發(fā)酵工藝條件模型分析及方差分析結(jié)果，回歸模型呈極顯著(P＜0.0001,P＜0.01)，該模型對(duì)響應(yīng)值擬合較好。發(fā)酵鱖魚(yú)模型決定系數(shù)R2為98.48%，其校正系數(shù)為96.52%，擬合程度良好，表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值較為接近，可信度高。一次項(xiàng)A、B與二次項(xiàng)AB呈顯著水平(P＜0.05)，影響發(fā)酵鱖魚(yú)感官品質(zhì)的因素順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量。該回歸方程的試驗(yàn)誤差較小且失擬項(xiàng)不顯著 (P=0.1127,P＞0.05)，可用于分析和預(yù)測(cè)發(fā)酵鱖魚(yú)的發(fā)酵工藝參數(shù)。

響應(yīng)面可直觀地反映發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)感官品質(zhì)的影響。如圖5所示，兩因素間的響應(yīng)面均為凸面，發(fā)酵鱖魚(yú)發(fā)酵工藝最優(yōu)條件存在于范圍內(nèi)。AB等高線圖呈橢圓形且曲面坡度較陡，因子間的交互作用較強(qiáng)，而AC與BC的等高線橢圓形相對(duì)不明顯，其交互作用較弱，可見(jiàn)發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間相互影響了發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，而發(fā)酵溫度與接種量，或發(fā)酵時(shí)間與接種量相互對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的影響較小。利用該模型進(jìn)一步分析，得到優(yōu)化后的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度21.54 ℃、發(fā)酵時(shí)間3.83 d、接種量1.04%，此工藝條件下生產(chǎn)的發(fā)酵鱖魚(yú)理論感官評(píng)分可達(dá)85.03分。考慮實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的有效控制和便利性，將得到的最佳工藝條件調(diào)整為發(fā)酵溫度22 ℃、發(fā)酵時(shí)間4 d、接種量1.0%，并以此工藝進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，最終得到發(fā)酵鱖魚(yú)感官評(píng)分為84.30分，實(shí)際值與理論值較為接近，說(shuō)明該模型能較好地模擬出發(fā)酵鱖魚(yú)的發(fā)酵工藝，并預(yù)測(cè)出最終的發(fā)酵鱖魚(yú)感官品質(zhì)。

圖5 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間與接種量對(duì)發(fā)酵鱖魚(yú)感官評(píng)分的交互影響Fig. 5 Interactive effects of fermentation temperature, fermentation time and inoculation amount on sensory score of fermented S. chuatsi

2.3 品質(zhì)分析

2.3.1 水分和 pH 分析

如表5所示，接種發(fā)酵鱖魚(yú)的pH略低于自然發(fā)酵鱖魚(yú)，因混合發(fā)酵劑具有較好的產(chǎn)酸特性，特別是乳酸菌能夠快速利用碳水化合物分解產(chǎn)生有機(jī)酸 (如乳酸)，從而促進(jìn)pH下降[14]。同時(shí)，鱖魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中因內(nèi)源酶和微生物作用，蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致堿性化合物產(chǎn)生，使其pH回升，故混菌接種發(fā)酵鱖魚(yú)的pH并未有明顯的變化，這與劉灑灑[15]的報(bào)道較為一致。與自然發(fā)酵鱖魚(yú)相比，混菌接種發(fā)酵鱖魚(yú)的水分下降約2%，這是因?yàn)橄鄬?duì)較低的pH使接種發(fā)酵鱖魚(yú)肌肉蛋白的持水力弱于自然發(fā)酵鱖魚(yú)。Hu等[16]評(píng)估了接種乳酸菌和木糖葡萄球菌的哈爾濱干香腸的品質(zhì)特征，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌種發(fā)酵可有效降低水分含量和水分活度。此外，工藝中食鹽添加量、原材料種類不同均會(huì)使其水分含量有所差異。

2.3.2 氨基態(tài)氮分析

氨基態(tài)氮主要經(jīng)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生，可反映出發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵程度和營(yíng)養(yǎng)蛋白水平[17-18]，被視為衡量產(chǎn)品質(zhì)量的重要參數(shù)之一。賀永玲等[19]報(bào)道鱖魚(yú)在自然發(fā)酵過(guò)程中氨基態(tài)氮含量呈逐漸增加趨勢(shì)。從表5可看出，混菌接種發(fā)酵鱖魚(yú)中氨基態(tài)氮含量與自然發(fā)酵鱖魚(yú)相當(dāng)，但發(fā)酵時(shí)間比自然發(fā)酵鱖魚(yú) (秋季) 時(shí)間縮短了7 d，說(shuō)明混菌接種發(fā)酵可使發(fā)酵鱖魚(yú)在較短時(shí)間內(nèi)有效提升氨基態(tài)氮含量。蛋白質(zhì)降解是影響發(fā)酵魚(yú)品質(zhì)和口感的重要因素，是內(nèi)源酶和微生物蛋白酶共同作用的結(jié)果[20]。鱖魚(yú)發(fā)酵期間，混菌可以產(chǎn)生蛋白酶并與魚(yú)肉中的內(nèi)源性肌肉蛋白酶協(xié)調(diào)作用，促進(jìn)魚(yú)肉肌原纖維蛋白和肌漿蛋白水解產(chǎn)生多肽、小肽和氨基酸等小分子物質(zhì)[21]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵劑可促進(jìn)魚(yú)露中氨基態(tài)氮含量增加，且發(fā)酵10 d后接種混合菌種發(fā)酵的樣品中氨基態(tài)氮含量高于單菌發(fā)酵[22]。

2.3.3 總酸分析

總酸含量也是反映鱖魚(yú)發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，有機(jī)酸對(duì)其滋味具有重要影響。自然發(fā)酵鱖魚(yú)總酸含量低于混菌接種發(fā)酵鱖魚(yú) (表5)?；炀械娜樗峋辛己玫漠a(chǎn)酸性能，通過(guò)代謝糖類物質(zhì)產(chǎn)生大量乳酸和乙酸等有機(jī)酸物質(zhì)。此外，在鱖魚(yú)發(fā)酵期間，有機(jī)酸、氨基酸的溶出和生成，含有羧基端的多肽產(chǎn)生，游離脂肪酸的積累等，有助于總酸含量的升高，同時(shí)含氮類等堿性物質(zhì)的生成則中和了部分總酸，這與發(fā)酵魚(yú)調(diào)味品的研究結(jié)果相似[23-24]。鱖魚(yú)在自然發(fā)酵過(guò)程中更易產(chǎn)生生物胺和揮發(fā)性鹽基氮等堿性物質(zhì)，從而影響總酸含量。

表5 發(fā)酵鱖魚(yú)理化指標(biāo)Table 5 Physiochemical properties of fermented mandarin fish

2.3.4 TBARS分析

魚(yú)肉中往往因富含不飽和脂肪酸而易發(fā)生氧化，使其氣味、滋味、色澤和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等品質(zhì)發(fā)生變化[25]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌具有良好的抗脂質(zhì)氧化活性，能有效抑制發(fā)酵魚(yú)不飽和脂肪酸的氧化，降低脂肪降解。表5顯示，與自然發(fā)酵鱖魚(yú)相比，接種發(fā)酵鱖魚(yú)的TBARS值降低35.00%，說(shuō)明混菌發(fā)酵可以減緩魚(yú)肉的脂肪氧化。某些細(xì)菌具有抗氧化酶和體外抗氧化能力，如一些乳酸菌和葡萄球菌可以抑制發(fā)酵肉制品的氧化[26-27]。Hu等[16]研究發(fā)現(xiàn)接種戊糖片球菌和木糖葡萄球菌至發(fā)酵魚(yú)腸中，對(duì)產(chǎn)品具有較好的抗氧化作用；Talon等[28]研究也證實(shí)部分葡萄球菌和乳酸菌具有抗氧化性能，如肉葡萄球菌可抑制新鮮豬油的氧化，用清酒乳桿菌發(fā)酵鱖魚(yú)可抑制腐敗菌及雜菌生長(zhǎng)，所產(chǎn)生的芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯、檸檬烯等揮發(fā)性香氣成分的含量增加[9]，說(shuō)明自然發(fā)酵過(guò)程有益優(yōu)勢(shì)菌形成慢，腐敗菌和氧化微生物分解魚(yú)肉蛋白和脂肪產(chǎn)生過(guò)度氧化等代謝產(chǎn)物。本研究采用由戊糖片球菌、清酒乳桿菌、肉葡萄球菌組成的混菌，能在鱖魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中迅速成為優(yōu)勢(shì)菌，從而抑制了腐敗菌和氧化菌的生長(zhǎng)，減緩了產(chǎn)品的氧化過(guò)程。

2.3.5 TVB-N 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

我國(guó)鮮海水魚(yú)TVB-N的限量值僅為30 mg·(100 g)-1，自然發(fā)酵鱖魚(yú)中TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá) (79.80±1.70) mg·(100 g)-1。自然發(fā)酵鱖魚(yú)中微生物種類十分復(fù)雜，在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵鱖魚(yú)中存在弧菌 (Vibrio spp.)、希瓦氏菌 (Shewanella spp.) 等腐敗微生物[1-2]。李燕[29]在鱖魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)有害菌的存在，這些微生物的生長(zhǎng)繁殖促使魚(yú)肉蛋白降解程度加劇，產(chǎn)生大量三甲胺、吲哚等含氮化合物，高含量的含氮化合物對(duì)產(chǎn)品安全性有不利影響。經(jīng)混菌接種發(fā)酵后，鱖魚(yú)的TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)與自然發(fā)酵鱖魚(yú)相比下降了53.10% (表5)，大大減少了含氮化合物的生成，說(shuō)明通過(guò)接種發(fā)酵劑可較好地抑制蛋白質(zhì)降解成胺類物質(zhì)，抑制TVB-N的產(chǎn)生，一定程度上提高了產(chǎn)品質(zhì)量。Liu等[30]也證明接種混合發(fā)酵劑可有效抑制TVBN的積累，其中乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和抗菌成分有助于中和TVB-N，并抑制病原體生長(zhǎng)。另一方面，少量氨類化合物的生成有助于發(fā)酵鱖魚(yú)風(fēng)味的形成，其“似臭非臭”的獨(dú)特氣味與其他發(fā)酵魚(yú)制品有所不同。因此，我國(guó)鮮海水魚(yú)的TVB-N標(biāo)準(zhǔn)可能不適用于發(fā)酵鱖魚(yú)的品質(zhì)評(píng)價(jià)，本研究將其作為參考標(biāo)準(zhǔn)，為下一步制定發(fā)酵魚(yú)類品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

采用混菌接種的方式生產(chǎn)發(fā)酵鱖魚(yú)，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定發(fā)酵鱖魚(yú)的最佳發(fā)酵工藝為：按m (戊糖片球菌)∶m (清酒乳桿菌)∶m (肉葡萄球菌)=1∶1∶3混合，接種量1.0%，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，表明其可滿足工廠生產(chǎn)需求。與自然發(fā)酵鱖魚(yú) (秋季) 相比，發(fā)酵時(shí)間縮短了7 d，產(chǎn)品的水分含量略有下降，蛋白水解作用明顯，氨基態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與自然發(fā)酵樣品十分接近，總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于自然發(fā)酵鱖魚(yú)，TBARS 和TVB-N顯著下降了35.00%和53.10%。采用混菌發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵工藝可控、縮短生產(chǎn)周期、保持產(chǎn)品原有風(fēng)味品質(zhì)、提高產(chǎn)品安全性。本研究為傳統(tǒng)發(fā)酵鱖魚(yú)的工藝技術(shù)改進(jìn)和質(zhì)量安全的可控提供了技術(shù)支撐和理論依據(jù)，有助于促進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)業(yè)的升級(jí)。