李晶晶，張瑞紅，王吉人，董洋洋，俞龍浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

宰后不同冷卻方式對(duì)荷斯坦公牛背最長(zhǎng)肌嫩度的影響

李晶晶，張瑞紅，王吉人，董洋洋，俞龍浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

為了比較不同冷卻方式對(duì)荷斯坦公牛背最長(zhǎng)肌嫩度特性的影響，取4頭公牛背最長(zhǎng)肌，左側(cè)傳統(tǒng)冷卻4℃放168 h，右側(cè)三段冷卻依次放入（4℃4 h，16℃4 h，4℃160 h）。結(jié)果顯示，宰后8、12、24 h處理組pH值低于對(duì)照組（P＜0.05），處理組的ATP含量和肌節(jié)長(zhǎng)度在宰后4 h和8 h之后低于對(duì)照組（P＜0.05），1、7、14、21 d處理組剪切力值低于對(duì)照組（P＜0.05），48 h后處理組MFI高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，相比傳統(tǒng)冷卻法，三段冷卻法使宰后荷斯坦公牛品質(zhì)得到進(jìn)一步提升。

荷斯坦公牛；冷卻方式；嫩度

牛肉的嫩度是決定牛肉食用的最重要因素，也是消費(fèi)者選購肉制品的重要指標(biāo)。其中除了牛肉的品種，年齡等一些生理因素對(duì)嫩度有影響外，最主要的還是宰后冷卻方式對(duì)牛肉嫩度的影響。一般的冷卻方式有常規(guī)冷卻，快速冷卻，延遲冷卻等等，而三段冷卻法不同于上述一般冷卻方式。三段冷卻法是目前研究較新的一種方法，即將宰后胴體放在三個(gè)不同層次溫度下進(jìn)行冷卻加工，使牛肉成熟過程加快，進(jìn)而提高肉的嫩度。Hollung等[1]研究發(fā)現(xiàn)，將宰后挪威紅牛背最長(zhǎng)肌在12℃冷卻10 h后，再貯藏在4℃，其剪切力值要顯著低于一直在4℃貯藏的對(duì)照組，表明處理組的嫩度比對(duì)照組明顯提高很多，加快了肉的嫩化過程。同時(shí)，Yu等[2]研究表明將Hanwoo牛背最長(zhǎng)?。ㄎ骼洌┮来钨A藏在24℃，4 h；12℃，4 h；2℃，16 h，其肌節(jié)長(zhǎng)度要比常規(guī)冷卻（2℃，24 h）增加，剪切力值減低。Li等[3]研究宰后不同的冷卻溫度對(duì)中國黃牛嫩度影響的實(shí)驗(yàn)表明，在宰后1 d溫度為14℃比0和7℃有較長(zhǎng)的肌節(jié)長(zhǎng)度，差異性顯著。目前對(duì)于宰后不同冷卻處理的中國荷斯坦公牛的卻鮮有研究報(bào)道，由此選取了的中國荷斯坦公牛背最長(zhǎng)肌進(jìn)行宰后不同冷卻方式的處理，探討三段冷法和傳統(tǒng)冷法對(duì)其宰后嫩度的影響。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

中國荷斯坦公牛（黑龍省大莊園肉業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)試劑與設(shè)備

主要試劑：HClO4（Sigma公司）、三乙胺磷酸（Sigma公司）、2%戊二醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、100 mmol·L-1KCl（Sigma公司）、11.2 mmol·L-1K2HPO4（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、8.8 mmol·L-1KH2PO4（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、1 mmol·L-1EGTA（Sigma公司）、1 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1NaN3（Sigma公司）。

主要試驗(yàn)儀器：均質(zhì)機(jī)（FA25，F(xiàn)LUKO）、離心機(jī)（5417R，Eppendorf，Germary）、紫外可見分光光度計(jì)（specord 210 plus，德國耶拿分析儀器有限公司）、移液槍（1000/200/100/20/10/2μl，Eppendorf，Germary）、液氮生物容器（YDS-5-200，成都金鳳）、插入式溫度計(jì)（TR-52，Thermo Recrdor）、電子天平（AR233CN/ CAV214C，OHAUS）、計(jì)時(shí)器（Eppendorf）、手提式pH（pH-K21，KBinar GmbH，Landsberg，Germany）、氦氖激光衍射器（Model No.212-2，Spectra-physics，USA）、質(zhì)構(gòu)儀（TA-XT2i，Stable Micro Systems，UK）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 取樣

將4頭荷斯坦公牛（540 kg±500 g）在黑龍江省大莊園肉業(yè)產(chǎn)業(yè)園的屠宰場(chǎng)按照商業(yè)屠宰工藝進(jìn)行屠宰。背最長(zhǎng)肌左邊的部分作為對(duì)照組，放在4℃的溫度下，存放168 h；背最長(zhǎng)肌右邊的部分作為處理組，依次放在4℃下4 h，16℃下4 h，4℃下160 h。在宰后0、4、8、12、24、48、72、168 h分別在荷斯坦公牛的背最長(zhǎng)肌左右部分中進(jìn)行取樣，測(cè)定胴體中心溫度、pH、ATP含量、肌節(jié)長(zhǎng)度、剪切力以及肌原纖維碎片（MFI）。

1.3.2 胴體中心溫度測(cè)定

宰后冷卻室的溫度和胴體的中心溫度是利用thermometer溫度計(jì)測(cè)定，將數(shù)字溫度計(jì)探針插入牛背最長(zhǎng)肌5 cm深，每5分鐘自動(dòng)記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 pH值測(cè)定

用手提式pH儀測(cè)定宰后胴體的pH值，先將pH儀探頭放入到pH值為4.6的緩沖溶液中，光亮顯示3次后，摁住“ENT”，當(dāng)顯示為0時(shí)，拿出放入第二個(gè)緩沖溶液中（pH值為7.0）同樣操作后，自動(dòng)回到“MEASURE”狀態(tài)，準(zhǔn)備待用。對(duì)所有選取的宰后時(shí)間點(diǎn)，0、4、8、12、24、48、72、168 h測(cè)定pH值。宰后不同冷卻方式下胴體pH值依照Hopkins等[4]spline模型表示。

1.3.4 ATP、ADP和AMP含量測(cè)定

ATP、ADP和AMP含量測(cè)定是稍微修改Wang等[5]方法進(jìn)行。取10 g經(jīng)過液氮冷凍后的樣品加入10%的HClO4溶液25 mL靜置10 min，使用高速均質(zhì)機(jī)在4℃，1 000 rpm下均質(zhì)3 min，隨后在0℃，15 000 rpm下離心10 min。上清液用5 mol·L-1的KOH調(diào)節(jié)pH值達(dá)到6.5，向其中加入10%的高氯酸使混合液達(dá)到100 mL，靜止30 min，過濾，將上清液在0℃，10 000 rpm下離心10 min，使用濾膜器（0.45 μm）進(jìn)行過濾。向色譜柱（Lichrospher RPC18，250×4.0 mm）中加入5 mL的上述濾液，非流動(dòng)相加入1%三乙胺磷酸（pH 6.5），流速為1.5 mL·min-1，圖的速度為0.5 cm·min-1，溫度為40℃，在254 nm波長(zhǎng)下測(cè)定化合物成分。

1.3.5 肌節(jié)長(zhǎng)度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)參照Voyle[6]等測(cè)定肌節(jié)長(zhǎng)度方法使用氦氖激光衍射器進(jìn)行測(cè)定。即順著肌原纖維方向取1～2 g肉樣放入2%的戊二醛溶液中保持30 min，在氦氖激光衍射器下記錄肌節(jié)長(zhǎng)度值。

1.3.6 剪切力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用Warner-Bratzler法測(cè)定樣品的剪切力值。在宰后1、7、14、21 d取300 g肉樣放入塑料袋，水浴加熱至中心溫度75℃，保持30 min，然后取出在0～4℃冰箱過夜。用直徑1 cm的中空取樣器沿肌纖維方向取樣（注意避開筋腱），用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀垂直肌纖維方向測(cè)定每個(gè)肉柱的最大剪切力值。同一肉塊所有的剪切力值的平均值即為該肉塊的最大剪切力值，參數(shù)為：測(cè)試速度5 mm·sec-1，觸發(fā)力5 g，載物重30 kg。

1.3.7 肌原纖維小片化（MFI）測(cè)定

參考Olson等[7]的方法修改測(cè)定。剪取待測(cè)定的牛肉樣品4 g，修整去除脂肪和結(jié)締組織后放入100 mL燒杯中，加40ml預(yù)冷（2℃）的MFI緩沖液（100 mmol·L-1KCl，11.2 mmol·L-1K2HPO4，8.8 mmol·L-1KH2PO4，1 mmol·L-1EGTA，1 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1NaN3），于冰浴中高速勻漿三次（10 000 rpm），每次30 S，勻漿后在2℃，1 000×g條件下離心15 min，棄去上清液，加入5倍體積的MFI緩沖液將沉淀懸浮，懸浮液用18目聚乙烯濾網(wǎng)過濾除去結(jié)締組織。利用Bradford法測(cè)濾液蛋白質(zhì)濃度，將懸浮液的濃度調(diào)整到0.5 mg·mL-1，在540 nm波長(zhǎng)度測(cè)定其吸光度。每個(gè)樣品一式三份，每份樣品三個(gè)重復(fù)同時(shí)進(jìn)行。

MFI=O.D.at 540 nm×200

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

使用SAS軟件（SAS Institute，Cary，NC）對(duì)宰后pH、ATP含量、肌節(jié)長(zhǎng)度、剪切力、MFI進(jìn)行差異性分析，采用origin（Origin Lab，USA）軟件對(duì)胴體中心溫度、pH和肌節(jié)長(zhǎng)度進(jìn)行作圖。樣品在同一宰后時(shí)間做三組重復(fù)，不同處理間的差異性用（P＜0.05）表示，所有的數(shù)據(jù)均以中間值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌中心溫度變化影響

圖1表示宰后不同冷卻方式對(duì)宰后牛背最長(zhǎng)肌中心溫度的影響。其中，傳統(tǒng)冷卻法（對(duì)照組）與三段冷卻法（處理組），基于splines擬合曲線表明，在宰后0～4 h內(nèi)，兩組胴體中心溫度迅速下降，在宰后16 h對(duì)照組下降到1.6℃，而處理組胴體中心溫度在宰后4～8 h維持在16.7±0.5℃，而后在18 h下降到1.6℃。

圖1 宰后不同冷卻方式下牛背最長(zhǎng)肌胴體中心溫度變化spline擬合曲線Fig.1Lines of best fit based on spline modelling of center temperature for control（solid）and treatment（dotted）on postmortem M.longissimus of beef

Frylinck等[8]報(bào)告，溫度和pH值對(duì)牛肉僵直開始和肉嫩度起重要作用。Medellin-Lopez等[9]報(bào)告，肌肉pH值低于6.2之前，肌肉溫度降到10℃以下容易發(fā)生冷收縮，肌肉溫度16℃時(shí)，冷收縮程度很小。Rhee[10]等和Lonergan等[11]還有研究指出牛宰后胴體溫度下降至10～15℃后，在此溫度下保持6 h，然后降到4℃以下，這樣可以防止冷收縮，并能有效抑制胴體表面微生物的生長(zhǎng)。

2.2 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌pH值的影響

動(dòng)物屠宰后呼吸活動(dòng)和心臟跳動(dòng)停止，實(shí)際上被切斷了外部營養(yǎng)供應(yīng)以及氧氣的輸送，肌糖原的新陳代謝由有氧代謝轉(zhuǎn)成無氧酵解，無氧酵解結(jié)果使乳酸不斷積累，導(dǎo)致宰后肌肉pH值下降。圖2表示宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌pH值的影響?；趕pline模型擬合曲線結(jié)果顯示，隨著宰后貯藏時(shí)間的增加，無論是處理組還是對(duì)照組，pH值都呈顯著下降趨勢(shì)。但是，宰后8、12、24 h處理組pH值顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。與宰后4 h pH值比較，處理組分別下降了0.64、0.81、0.9，而對(duì)照組分別下降了0.20、0.47、0.79。尤其是宰后8 h和12 h處理組pH值下降幅度顯著大于對(duì)照組。這是由于在實(shí)驗(yàn)中宰后4 h到8 h處理組冷卻環(huán)境溫度從0℃提高到16℃，使肌肉中心溫度大約維持在16℃，加速了無氧酵解過程的結(jié)果。此結(jié)果與yu等[2]研究報(bào)告基本一致。同時(shí)Pike[12]等指出肌肉的最終pH值主要是受糖原降解情況的影響，而與降解相關(guān)的因素即肌糖原本身的含量即肌糖原含量高，肌肉最終pH值可能較低。

圖2 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌pH的影響Fig.2Lines of best fit based on spline modelling of pH forcontrol（black circles）and treatment（open circles）on postmortem M.longissimus of beef

2.3 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌ATP含量的影響

表1表示宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌ATP含量的影響。結(jié)果表明，宰后4 h為止處理組和對(duì)照組基本維持同一水平，但是宰后8 h對(duì)照組ATP水平顯著低于處理組。雖然宰后24 h與0 h相比，處理組的ATP值下降了72%，對(duì)照組下降了83%，但到宰后24 h達(dá)到了同一水平。ATP水平的降低可能引起肌肉僵直開始。在實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組宰后8 h ATP水平顯著低于處理組，暗示著對(duì)照組可能比處理組先進(jìn)入肌肉僵直階段，同時(shí)測(cè)定在宰后8 h肌節(jié)長(zhǎng)度結(jié)果中顯示對(duì)照組的肌節(jié)長(zhǎng)度顯著小于處理組（圖3），符合前人研究的ATP水平?jīng)Q定肌肉僵直起始點(diǎn)的報(bào)告[5]。Kuda等[13]研究表明隨著宰后無氧酵解的進(jìn)行，乳酸積累使pH降低，導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+束縛能力下降，流出的Ca2+激活肌球蛋白前段結(jié)合的ATP酶，使ATP分解，導(dǎo)致ATP值迅速降低。然而在實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，宰后4 h后處理組的pH值下降速度顯著快于對(duì)照組，但是宰后8 h的處理組ATP含量卻顯著高于對(duì)照組，這可能是由于處理組采用三段冷卻處理，使宰后4 h到8 h時(shí)間段肌肉溫度維持在16℃附近，避免冷收縮的發(fā)生，緩和了迅速消耗ATP的結(jié)果。同時(shí)若哺乳動(dòng)物的紅色肌肉在僵直前肌肉溫度迅速降低時(shí)，由于線粒體機(jī)能降低釋放出較多的Ca2+，從而更容易引起冷收縮[14]。同時(shí)，ADP和AMP在貯藏期間的變化結(jié)果與ATP水平變化相吻合。

表1 宰后不同冷卻方式在0、4、8、24 h對(duì)牛背最長(zhǎng)肌ATP變化的影響Table 1Effect of different chilling methods on ATP，ADP and AMP of M.longissimus in beef at 0，4，8 and 24 h postmortem

2.4 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌肌節(jié)長(zhǎng)度的影響

圖3顯示了宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌肌節(jié)長(zhǎng)度的影響。

圖3 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌肌節(jié)長(zhǎng)度的影響Fig 3Lines of best fit based on spline modelling of sarcomere length for control（black circles）and treatment（open circles）on postmortem M.longissimus of beef

在實(shí)驗(yàn)中宰后4 h后對(duì)照組的肌節(jié)長(zhǎng)度均顯著小于處理組（P＜0.05）。對(duì)照組的肌節(jié)長(zhǎng)度在宰后4 h后到24 h為止急劇縮短，縮短幅度為0.67 μm，而處理組在此期間只縮短了0.19 μm。這可能是由于傳統(tǒng)冷卻方式下肌肉可能引起冷收縮的結(jié)果[2]。而處理組在此期間較小的收縮程度表明，三段冷卻處理方式可以避免冷收縮的發(fā)生，同時(shí)可能緩和宰后僵直收縮程度。另外，宰后24 h到168 h為止處理組的肌節(jié)長(zhǎng)度仍然顯著大于對(duì)照組，說明即使經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的成熟過程宰后肌肉的強(qiáng)烈收縮也很難達(dá)到僵直期間有效抑制的程度，從而可能影響肉的嫩度改善。

2.5 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌剪切力的影響

在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定剪切力值結(jié)果如圖4所示。在宰后1、7、14、21 d處理組的剪切力值顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），顯示出隨成熟時(shí)間增加，其嫩度差異更加明顯的現(xiàn)象。這與圖3中測(cè)定的處理組中肌節(jié)長(zhǎng)度下降緩慢相符合。但是隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組和對(duì)照組之間肌節(jié)長(zhǎng)度差異是逐漸減小的，而卻出現(xiàn)剪切力差異性反而變大的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象暗示，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，肌節(jié)長(zhǎng)度對(duì)嫩度的影響越來越小，其他影響嫩度的因素會(huì)越來越多，且更復(fù)雜。

圖4 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌剪切力變化的影響Fig 4Changes in M.longissimus postmortem shear force using conventional（control）and three-step chilling（treatment）methods

2.6 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌MFI變化的影響

肌原纖維小片化指數(shù)作為肌原纖維斷裂程度的重要指標(biāo)，且與肉的嫩度相關(guān)[15-17]。實(shí)驗(yàn)中肌原纖維小片化指數(shù)測(cè)定結(jié)果如圖5所示。到宰后24 h為止，處理組和對(duì)照組均未顯著增加，其后才開始顯著增加。到48 h以后處理組肌原纖維小片化指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。這一結(jié)果與剪切力測(cè)定結(jié)果基本一致，且表明在宰后三段處理方式中，可能加速肌原纖維小片化進(jìn)程，從而有利于嫩度改善。同時(shí)表明，隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維斷裂進(jìn)程的因素對(duì)嫩度的影響可能更重要。

圖5 宰后不同冷卻方式對(duì)牛背最長(zhǎng)肌MFI變化的影響Fig 5Changes in M.longissimus postmortem MFI using conventional（control）and three-step chilling（treatment）methods

3 結(jié)論

宰后初期，與傳統(tǒng)冷卻法相比，三段冷卻法由于在宰后4～8 h期間胴體中心溫度維持在16℃左右，加速了宰后代謝過程，導(dǎo)致其背最長(zhǎng)肌的pH值下降迅速（P＜0.05），這將有利于抑制胴體表面微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)使ATP下降趨與緩慢，有效地延遲肌肉僵直的起始時(shí)間。與傳統(tǒng)方法相比三段冷卻法處理的背最長(zhǎng)肌的肌節(jié)長(zhǎng)度大、肌原纖維小片化指數(shù)高，剪切力低且差異顯著（P＜0.05）。此結(jié)果表明，與傳統(tǒng)冷卻法相比，三段冷卻法可以使荷斯坦公牛背最長(zhǎng)肌得到更高的嫩度，使宰后荷斯坦公牛肉的品質(zhì)得到進(jìn)一步提升。

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Effect of Different Chilling Methods on Tenderness in M.longissimus lumborum of Holstein Bulls

Li Jingjing，Zhang Ruihong，Wang Jiren，Dong Yangyang，Yu Longhao
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To compare the effect of different chilling methods on tenderness in M.longissimus lumborum of Holstein bulls.The left sides of carcasses were chilled for 168 h at 4℃（conventional chilling）as controls.The right sides of carcasses were chilled for 4 h at 4℃，4 h at 16℃and 160 h at 4℃（three-step chilling method）as the treatment samples.The results indicated that the pH of treatment was lower than the control at 8 h，12 h and 24 h postmortem（P＜0.05）.Sarcomere length and ATP was much greater in treatment group than control group at 4 h，8 h postmortem（P＜0.05），respectively.The MFI of treatment was higher than the control（P＜0.05）.The shear force of treatment was lower than the control（P＜0.05）on days 1，7，14，21 postmortem（P＜0.05）.The results suggested that 3-step chilling method might improve quality of Holstein bulls compared to the traditional three-stage chilling method.

Holstein bulls；chilling methods；tenderness

TS251.4

A

1002-2090（2017）01-0054-05

2015-11-15

國家自然基金（31171712）。

李晶晶（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2013級(jí)碩士研究生。

俞龍浩，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：meat2011@126.com。