吳磊，吳靜，胡居吾，熊偉，顧震，王慧賓

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

自由基是一種具有高氧化活性的原子、分子或離子，在新陳代謝過程中可以攜帶一種或多種不對稱的電子。生物體在代謝過程中產(chǎn)生的自由基是超氧陰離子自由基、羥基自由基及其衍生物。正常情況下，自由基調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號和細(xì)胞生長，抑制病毒和細(xì)菌。然而，體內(nèi)過多的自由基會損傷細(xì)胞、組織和器官，誘發(fā)許多疾病和生理疾病，如炎癥、癌癥、衰老和輻射損傷[1]。因此，有效清除體內(nèi)多余的自由基是非常重要的。巨噬細(xì)胞通常是宿主防御系統(tǒng)的第一道防線，在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中具有重要作用。巨噬細(xì)胞表面的受體，如Toll樣受體（TLR）和補(bǔ)體受體3型（CR3）可能與多糖作用，刺激巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮（NO）和細(xì)胞因子殺死病原體[2]。因此，外源性抗氧化劑和巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力可能在抗病毒防御中具有的重要作用。

多糖不僅是高等植物、動物細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁的重要組成部分。它還與生物的生理功能密切相關(guān)。多糖作為新一代的天然藥物資源，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等重要的生物學(xué)特性，其中，抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性被認(rèn)為是多糖的兩種主要的生物活性，特別是阿拉伯半乳聚糖、半乳甘露聚糖和來自高等植物的果膠多糖以及從蘑菇中提取的糖蛋白、海藻中提取的硫酸多糖都被證明具有很強(qiáng)的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性。由于其安全性和無毒性，其中一些多糖已被成功地用作抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑[1,2]。因此，鑒于其在功能食品和醫(yī)療領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，人們越來越關(guān)注從天然產(chǎn)物中開發(fā)新型的植物源多糖。

蓮（Nelumbo nucifera），睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物。蓮屬植物主要分為兩種，包括中國蓮（N.nuciferaGaertn）和美洲黃蓮（N.nuciferaFemald）[3]。目前，我國擁有的荷花品種多達(dá)800個以上，主要分布于福建、浙江、湖北、湖南、江蘇、安徽以及江西等地[4]。蓮富含生物堿、黃酮、糖苷類、三萜類、多糖、多酚、揮發(fā)油等多種活性成分，具有抗氧化、消炎、抗菌、抗心律失常、降血糖、止瀉、免疫調(diào)控等生理活性[5-9]。廣昌白蓮，中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。廣昌縣自古以來就被稱為 “ 蓮鄉(xiāng) ” ，歷來被稱為 “ 貢蓮 ” ，為 “ 蓮中珍品 ” ，一直暢銷海內(nèi)外。目前關(guān)于蓮產(chǎn)品的開發(fā)與研制多停留在蓮葉、蓮子與蓮心等植物器官制品上，而對于廢棄下腳料蓮子皮（約占整個蓮子重量的15%）的研究較少，目前只是作為廢棄物被隨意丟置于路邊或溝旁，腐爛霉變，或直接掩埋和焚燒。這不僅造成環(huán)境污染，還是對蓮資源的極大浪費(fèi)。國內(nèi)外目前對蓮子皮中化學(xué)成分及其藥用作用的相關(guān)研究只有 “ 零星 ” 報道[10,11]，一直未得到重視。本研究旨在通過熱水提取法從白蓮蓮子皮中提取純化多糖，并對純化后的多糖進(jìn)行表征，研究純化多糖的抗氧化與免疫調(diào)節(jié)活性。旨在為合理開發(fā)利用白蓮蓮子皮資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蓮蓮子皮為廣昌縣白蓮科學(xué)研究所提供，由徐剛研究員鑒定為白蓮的蓮子皮，樣本編號為LP-201707，已存放在江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究天然產(chǎn)物研究室的植物標(biāo)本室。

所有標(biāo)準(zhǔn)品包括D-葡萄糖（Glc）、D-半乳糖（Gal）、L-鼠李糖（Rha）、L-阿拉伯糖（Ara）、D-木糖（Xyl）和D-甘露糖（Man）均購自中國食品藥品檢定研究院；1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購于Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、脂多糖（LPS）、維生素C（Vc）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）以及2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）均購于Sigma公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒均購自南京建城生物工程研究所。除非另有規(guī)定，否則使用的所有其他試劑均為分析級試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速冷凍離心機(jī)：H1850型，廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；冷凍干燥機(jī)FDU-1200：EYELA東京理化；分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Tecan Infinite 200 PRO M Nano酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；KQ-500B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；CLM-170B-8-NF二氧化碳培養(yǎng)箱：新加坡ESCO公司；奧林巴斯倒置顯微鏡CKX53：日本Olympus公司；SYKAM S501 Series高效液相色譜儀；S-3250示差檢測器；S-4115柱溫箱；S-5300自動進(jìn)樣器；S-1130 四元泵；SYKAM 色譜工作站；氣相色譜儀：GC-2010型，SHIMADZU公司；氣相色譜檢測器：FID；色譜柱：WondaCap5型毛細(xì)管柱（0.25 mm×30.0 m×0.25 μm）；自動進(jìn)樣器：AOC-20S型，SHIMADZU公司；自動注射器：AOC-20i型，SHIMADZU公司；傅立葉紅外光譜儀：FTIR-7600型，Lambad公司；壓片機(jī)：DF-4型，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蓮子皮粗多糖的提取

將陰干的蓮子皮粉碎（500 g），用95%乙醇在80 ℃下熱回流提取6 h以去除脂類、色素、單糖和小分子化合物。殘渣在50 ℃的烘箱中干燥以獲得脫脂的蓮子皮粉。稱取100 g脫脂粉末，以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1:30（m/V），在90 ℃下的熱回流提取三次，每次提取3.5 h。提取液經(jīng)離心、過濾，使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至適當(dāng)體積，加入4倍體積的無水乙醇混合，置于4 ℃冰箱過夜，在12000 r/min下離心10 min后，通過冷凍干燥獲得白蓮蓮子皮粗多糖(LSSCP)。

1.3.2 蓮子皮多糖的純化

將所得蓮子皮粗多糖（1 g）加熱水10 mL溶解，然后加入sevage試劑（正丁醇:氯仿=1:4，V/V）充分震蕩，在分液漏斗中靜置，此步驟重復(fù)三次去除蛋白質(zhì)，合并上層液體，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮去除有機(jī)溶劑殘留。并加入粗多糖質(zhì)量10%的活性炭，60 ℃、150 r/min攪拌3 h，抽濾，濃縮。濃縮液裝入截留分子量為3000 u的透析袋中用自來水透析48 h，蒸餾水透析48 h以去除小分子化合物，將透析后的多糖溶液經(jīng)冷凍干燥得到純化蓮子皮多糖（LSSP）[12]。

1.3.3 多糖結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 蓮子皮多糖含量測定

蓮子皮的多糖含量采用經(jīng)典的苯酚硫酸法[13]進(jìn)行測定，使用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)取線，計算多糖含量。

1.3.3.2 紅外光譜分析

將2 mg的LSSP與KBr粉末150.0 mg（光譜級）混合，用壓片機(jī)壓制成厚度為1 mm透明薄片，用于FT-IR測量。使用傅里葉變換紅外分光光度計測定了波長范圍為400～4000 cm-1的FT-IR光譜，分辨率為2 cm-1觀察譜峰情況。

1.3.3.3 分子量測定

采用SYKAM S501 Series高效液相色譜儀測定經(jīng)過純化后得到的蓮子皮多糖分子量大小。使用五種葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)分子量（Mw）（分別為Mw 10000 u、40000 u、70000 u、200000 u和2000000 u）進(jìn)行校準(zhǔn)。將標(biāo)準(zhǔn)品配制成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過0.22 μm微孔膜，在上述條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜峰保留時間（T）為橫坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的平均分子量。該值（lgMw）為縱坐標(biāo)，得到回歸方程。色譜條件：TSKG5000色譜柱；流動相：0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）；流速：0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，運(yùn)行時間30 min。將樣品配成10 mg/mL的LSSP溶液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。

1.3.3.4 單糖組分測定

根據(jù)先前報告的方法[13]，將LSSP（10.0 mg）在100 ℃下，用2 mL的2 M三氟乙酸（TFA）在密封玻璃管中水解6 h。水解物在氮吹儀下至干。然后，將10.0 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶加入密封玻璃管中，在90 ℃下反應(yīng)30 min，孵育后，室溫冷卻，混合液中加入0.5 mL乙酸酐，旋渦徹底混合。將管密封并在水浴中孵育30 min，溫度為90 ℃。反應(yīng)液在氮吹儀下至干，加入2 mL氯仿溶解乙?；苌?。單糖標(biāo)準(zhǔn)品（單標(biāo)與混標(biāo)）與內(nèi)標(biāo)按照多糖的乙酰化步驟進(jìn)行操作。采用氣相色譜法測定LSSP中的單糖組成，在以下條件下進(jìn)行氣相色譜操作：N2：30.0 mL/min；進(jìn)樣溫度為240 ℃，柱色譜程序為：初始溫度：140 ℃，保留3 min；以10 ℃/min時升至240 ℃，保留15 min；運(yùn)行時間：28 min，檢測器溫度：260 ℃；進(jìn)樣體積為1 μL。

1.3.4 多糖活性實驗

1.3.4.1 清除DPPH自由基能力的測定

多糖樣品的DPPH自由基清除活性的測定方法[14]根據(jù)之前文獻(xiàn)報道稍作修改。將3 mL的新鮮配置濃度為200 μmol/L的DPPH溶液作為自由基的母液分別加到不同濃度的樣品溶液中，樣品溶液的濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL，所需樣品的體積為1 mL。溶液快速搖動混合，并在25 ℃下反應(yīng)25 min。將Vc用作陽性對照，吸取反應(yīng)液至96孔板中，在517 nm用酶標(biāo)儀測定吸光度。DPPH自由基清除率由下式計算

式中，A1：對照品溶液（無樣品）的吸光度；A2：樣品溶液的吸光度。

1.3.4.2 ·OH自由基清除能力的測定

根據(jù)獻(xiàn)[14]方法測定羥自由基清除活性。將1 mL不同濃度的多糖溶液（0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL）、1 mL硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）和1 mL水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L）混合。用1 mL的0.1%過氧化氫搖勻，然后在37 ℃下黑暗反應(yīng)30 min。取反應(yīng)液200 μL轉(zhuǎn)移至96孔板中，以Vc為陽性對照。用酶標(biāo)儀在510 nm下測定吸光度A。根據(jù)下列公式計算LSSP及Vc的·OH自由基清除率:

式中，A0：蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照的吸光度；A：樣品吸光度。

亂象歸亂象，流量歸流量。人們應(yīng)該清醒地意識到，當(dāng)前充斥于自媒體領(lǐng)域的“失范”現(xiàn)象，是媒體轉(zhuǎn)型期的特殊現(xiàn)實。

1.3.4.3 Fe3+還原能力的測定

按文獻(xiàn)方法測定多糖的鐵還原抗氧化能力[15]。將0.8 mL樣品（0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL）與0.4 mL磷酸鹽緩沖液（pH=6.6，0.2 mol/L）和0.4 mL鐵氰化鉀溶液（1%，W/V）混合，并在50 ℃下反應(yīng)20 min，然后再將0.4 mL三氯乙酸溶液（10%，W/V）加入。靜置10 min，加入1.6 mL蒸餾水和0.4 mL氯化鐵溶液（0.1%，W/V），室溫下靜置10 min，然后在700 nm處測定樣品的吸光度。以Vc為陽性對照。

1.3.4.4 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞系是一種小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），用RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需添加10%胎牛血清（在56 ℃水浴中熱滅活30 min）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。培養(yǎng)基每2～3 d更換一次。當(dāng)融合率達(dá)80%，傳代培養(yǎng)。

1.3.4.5 細(xì)胞活性檢測-MTT法

LSSP對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響通過常規(guī)MTT法[12]進(jìn)行測量，對數(shù)生長期細(xì)胞以1×106個細(xì)胞/孔接種于96孔板中。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后，向懸浮液中加入不同濃度的LSSP，孵育24 h，吸取上清液，加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL MTT停止液。繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h后，在550 nm處用酶標(biāo)儀測量吸光度，實驗重復(fù)三次。細(xì)胞存活率按照以下公式進(jìn)行計算：

式中，A1：實驗組孔吸光值；A2：空白組孔吸光值；A3：對照組孔吸光值。

1.3.4.6 對細(xì)胞因子分泌量的影響

將RAW264.7巨噬細(xì)胞（1×105個/mL）接種于48孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，洗舊培養(yǎng)基，用不同濃度（12.5、25、50、100、200或400 μg/mL）的LSSP和1 μg/mL LPS（陽性對照）在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，NO的分泌量采用Griess法進(jìn)行檢測，具體以亞硝酸鈉為標(biāo)品，配置不同濃度的亞硝酸溶液，加入Griess試劑反應(yīng)測其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量。

試驗數(shù)據(jù)處理和作圖軟件采用Excel 2013及Sigmaplot 10.0軟件，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。兩組間的顯著性采用t檢驗進(jìn)行分析，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行比較。p值小于0.05被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蓮蓮子皮多糖的提取與純化

按照方法步驟1.3.1與1.3.2所得白蓮蓮子皮粗多糖和純化多糖的質(zhì)量分別為7.92 g和0.47 g，多糖得率的計算方式為與投藥量的比值，經(jīng)計算粗多糖與純化多糖的得率分別為9.45%和3.72%，粗多糖與純化多糖含量經(jīng)苯酚-硫酸法測得梯度葡萄糖的吸光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：Y=0.0031X+0.0182，R2=0.9993，其中Y為吸光度，X為濃度。測得粗多糖與純化多糖含量分別為35.78%和86.79%。這可能由于在多糖純化過程中，選擇了單一的純化方式，所得純化的多糖中可能還含有大分子物質(zhì)和微粒如水溶性高聚物、多肽、核酸以及殘留色素等雜質(zhì)成分。徐虹等[16]利用酶解研究蓮子紅皮多糖的得率可達(dá)8.42%，所得多糖純度為83.19%；李楊等[17]超聲波輔助提取蓮子皮多糖，多糖提取率為17.37%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.75%。比本研究白蓮蓮子皮粗多糖的得率和純度都要高，這可能是由于蓮的種類、提取方式的不同引起的。

2.2 紅外光譜分析

圖1 LSSP的紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of LSSP

紅外吸收是由分子偶極矩或電荷分布的振動而引起。是分析多糖結(jié)構(gòu)的有效手段，根據(jù)多糖的特征吸收峰可推斷出其組分一些可能的結(jié)構(gòu)特征。紅外光譜分析了LSSP的主要官能團(tuán)和化學(xué)鍵，結(jié)果如圖1所示，3397 cm-1處的特征峰是由于O-H伸縮振動引起的；峰值出現(xiàn)在3000～2800 cm-1處是由于飽和的甲基或亞甲基的C-H伸縮振動引起的[18]，2977 cm-1是LSSP糖環(huán)上的C-H伸縮振動。信號在1608 cm-1處的特征吸收峰歸因于結(jié)合水引起的[19]；在1400 cm-1處的吸收峰歸因于C=C的拉伸振動和C-H的變形振動[20]；吸收波長在1049 cm-1處的吸收峰是C-O-H中O-H的變角振動所引起的，在多糖紅外光譜中，可能是LSSP中C-4位C-O的振動[21]。在877 cm-1的觀察帶表明，LSSP可能含有α構(gòu)型糖苷鍵[22]。LSSP的紅外吸收光譜顯示，與其它多糖相比，在667 cm-1附近有一個吸收峰，這可能是由于糖鏈上的芳香峰和芳香族C-H彎曲振動的吸收峰所致[23]。紅外光譜表明LSSP多糖在400～4000 cm-1范圍內(nèi)有明顯的多糖特征吸收峰。

2.3 單糖組成及其分子質(zhì)量分析

圖2 標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖（a）與樣品氣相色譜圖（b）Fig.2 GC chromatogram of complex monosaccharide derivative

通過對6種標(biāo)準(zhǔn)單糖和蓮子皮多糖樣品先后進(jìn)行氣相色譜分析，由圖2a得知，6種單糖標(biāo)準(zhǔn)品在此色譜下分離完全。蓮子皮多糖單糖組成由圖2b所示，13.35 min處的單糖由于缺少相應(yīng)單糖標(biāo)品，暫時未分析出來。蓮子皮多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖組成，六種單糖的摩爾比為2.23:3.47:1.00:3.08:4.27:7.00，其中半乳糖含量最大，為33.25%，葡萄糖和阿拉伯糖次之。劉恩超、孫豐婷等[24,25]研究發(fā)現(xiàn)蓮藕渣多糖主要由半乳糖和阿拉伯糖組成，其中半乳糖的含量最高，為25.98%，鄧添華等[26]研究表明蓮子多糖中半乳糖的含量最高，都與本研究的結(jié)果一致，推測半乳糖是一種存在于蓮多糖中的含量最高的單糖。

多糖的分子量具有相對性，代表相似鏈長的平均分布，通常用統(tǒng)計平均值來表示所測定的多糖分子量大小[27]。采用高效液相色譜法測定不同標(biāo)準(zhǔn)品分子重量。以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間（T）為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的分子量平均值取對數(shù)（lgMw）為縱坐標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線LgMw=9.6167-0.2897T，（R2=0.9967）（其中Mw是分子量，T表示保留時間）計算LSSP相對分子量。LSSP有兩組不同的分子量分布，如圖3所示，出峰時間分別為23.52 min和24.15 min，平均分子量分別為6.35×105u和4.18×105u，屬于非均一多糖。Tian等[28]利用超聲輔助提取蓮子多糖，并利用柱色譜純化后檢測分總量為4484 u，小于本研究的蓮子皮多糖的平均分子量，這可能由于原料、提取純化方式的不同造成的。

圖3 LSSP的分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution chromatograms of LSSP

2.4 白蓮蓮子皮多糖的體外抗氧化活性

2.4.1 對DPPH的清除效果

DPPH是一種非常穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，如能消除，說明供試品具有降低過氧化自由基和中斷脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的作用，是基于抗氧化劑的供氫能力。它廣泛用于測定各種抗氧化劑樣品的抗氧化能力，其方法簡單、快速、靈敏。DPPH在乙醇溶液中呈紫色。DPPH的顏色與DPPH自由基含量呈正相關(guān)。DPPH在紫外517 nm處的有最大吸收峰。通過比較加樣前后吸光度的變化來計算DPPH自由基的清除率[29]。如圖4a所示，蓮子皮多糖的DPPH自由基清除率隨濃度從0.025～0.4 mg/mL呈劑量依賴性增加，但均小于Vc。在0.1 mg/mL濃度下，Vc對DPPH自由基的清除作用迅速提高，達(dá)到91.34%，之后隨著濃度的增加，其清除率逐漸趨于平緩。而蓮子皮多糖對DPPH自由基的清除作用在濃度為0.025～0.2 mg/mL時增強(qiáng)較快，后趨于平緩，在0.2 mg/mL和0.4 mg/mL時，其清除率分別為57.76%和59.75%。薛淑靜[30]研究發(fā)現(xiàn)蓮子紅皮多糖對DPPH有清除作用，多糖濃度在0～120 μg/mL時清除作用隨濃度的增大呈增長趨勢，在120 μg/mL時最大，達(dá)到41.79%，之后清除率呈下降趨勢，與本研究結(jié)果基本一致。

圖4 LSSP對DPPH(a)、·OH(b)自由基清除能力以及還原能力(c)Fig.4 The scavenging effect on DPPH (a), hydroxyl (b) radicals and reducing power (c) ability of polysaccharide

2.4.2 對·OH自由基清除能力

羥基自由基（·OH）是一種高度氧化的自由基。它能與生物體內(nèi)的任何物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，特別是脫氧核糖核酸（DNA）中的嘌呤和嘧啶，羥基自由基具有強(qiáng)大的破壞力，會導(dǎo)致細(xì)胞死亡或突變[31]。這個實驗的原理是羥基自由基由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，水楊酸反應(yīng)與·OH形成有色物質(zhì)，在510 nm下有紫外吸收。當(dāng)添加樣品時，有色化合物的產(chǎn)生會減少，峰值相應(yīng)減小，以此來計算樣品的清除能力。如圖4b所示，Vc具有良好的清除羥基自由基能力，當(dāng)Vc濃度為0.1 mg/mL，清除率達(dá)89.77%，但是，隨著Vc濃度的增加，其清除率基本趨于平緩趨勢。從圖中可以看出蓮子皮多糖的清除率隨濃度的增加而增加，但是整體清除率比Vc低。在給藥濃度范圍內(nèi)，蓮子皮多糖的清除率在濃度為0.4 mg/mL時達(dá)到最大，其清除率為59.75%。薛淑靜[30]研究發(fā)現(xiàn)蓮子紅皮多糖對·OH有一定的清除作用。隨著多糖濃度的不斷增加，對·OH的清除作用呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢，多糖濃度6.0 mg/mL時，趨勢漸緩；多糖濃度10.0 mg/mL時清除率最高，達(dá)到96.29%，與本研究趨勢基本一致，所不同的是本研究中并未研究濃度更大的蓮子皮多糖對·OH自由基清除能力。

2.4.3 還原力的測定

多糖的還原能力與抗氧化活性有關(guān)。因此，多糖還原能力的測定可以間接比較多糖的抗氧化能力。本實驗的原理是還原劑將鐵氰化鉀中的Fe3+還原成Fe2+，與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)。產(chǎn)物在700 nm處有最大吸收值。吸光值越高，還原劑的還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性越好[32]。樣品的還原能力結(jié)果如圖4C所示。可見Vc的還原能力最強(qiáng)。其增長趨勢與清除DPPH自由基的結(jié)果基本一致，隨著樣品濃度的增加，先迅速增長，然后趨于平緩Vc。而樣品的還原能力雖然隨著給藥濃度的增加而有所增強(qiáng)，但是增加幅度偏小，蓮子皮多糖還原能力在給藥濃度為0.4 mg/mL時達(dá)到最大，其吸光值為0.55。

2.5 LSSP對細(xì)胞存活率的影響

圖5 LSSP對RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effect of LSSP on the viability of RAW264.7 cells(*p<0.05)

在研究LSSP的免疫調(diào)節(jié)活性之前，采用MTT法測定多糖對RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖作用的影響。如圖5所示，在用LSSP（200、100、50、25、12.5 μg/mL）時，細(xì)胞存活率分別為99.67%、96.53%、104.12%、102.45%、99.65%，說明LSSP（200 μg/mL以下）對于細(xì)胞是安全的，在安全的濃度范圍內(nèi)可以進(jìn)行下面的實驗研究。

圖6 LSSP對NO、細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的影響Fig.6 Effects of LSSP treatment on the secretion of (A) NO,(B–D) cytokine (TNF-α, IL-1β and IL-6) in RAW 264.7 cells.

2.6 LSSP對RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6和IL-1β分泌的影響

巨噬細(xì)胞積極參與宿主對外源性病原體和微生物的免疫防御，能夠增強(qiáng)促炎因子和趨化因子的產(chǎn)生。多糖可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能發(fā)揮多種有益的藥理作用。NO是參與巨噬細(xì)胞的抗菌活性和抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要物質(zhì)之一，NO是由L-精氨酸通過一氧化氮合酶（NOS）合成的，眾所周知，NO在感染過程中起著關(guān)鍵作用，能夠抑制病原體的增殖和生長[33]。TNF-α是目前發(fā)現(xiàn)的最具殺滅腫瘤作用的細(xì)胞因子之一，而IL-6是在免疫細(xì)胞間傳遞信號的關(guān)鍵細(xì)胞因子[34]。

本研究觀察了LSSP對NO、細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的影響。正常組中RAW264.7細(xì)胞只釋放少量的NO（3.12 μM）、TNF-α（5.52 ng/mL）、IL-6（8.43 ng/mL）和IL-1β（27.56 ng/mL），如圖6a～d所示，與正常組相比，LSSP（25、50、100和200 μg/mL）處理能顯著促進(jìn)NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，呈劑量依賴性。在添加LSSP濃度為200 μg/mL時，NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量達(dá)到了最大值，與空白組相比，NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量分別增加了48.86 μM、98.75 ng/mL、85.64 ng/mL和46.67 ng/mL。然而，用LSSP（100和200 μg/mL）處理后NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌緩慢增加說明LSSP對巨噬細(xì)胞的激活是有限的，過度激活巨噬細(xì)胞將會導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。眾所周知，脂多糖會誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥。然而，LSSP對巨噬細(xì)胞的作用遠(yuǎn)小于LPS。

文獻(xiàn)報道蓮藕、荷葉、蓮子、蓮藕節(jié)、藕皮、蓮子等器官的多糖能夠刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO和細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）來增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)活性，與本研究基本一致，說明蓮的不同器官的多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性。另外有研究發(fā)現(xiàn)多糖對巨噬細(xì)胞的免疫刺激作用依靠受體的識別。識別的分子基礎(chǔ)取決于多糖的結(jié)構(gòu)特征，包括分子量、糖基殘基和鏈構(gòu)象，分子量較大的多糖可能含有較多的多糖高度重復(fù)的結(jié)構(gòu)可以多向性交叉連接受體或其他膜靶向增強(qiáng)免疫刺激效果。本研究中LSSP就有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性可能與其分子量較大有一定的關(guān)系。

3 結(jié)論

3.1 目前對多糖活性的大量研究表明，從植物中提取的天然多糖具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗氧化作用。多糖的生物活性與單糖組成、分子量、糖苷鍵和化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)[35]。因此，多糖結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)表征是研究多糖生物活性的重要的一步。LSSP單糖組成分析表明，LSSP是一種雜多糖，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其中半乳糖含量最大，為33.25%，葡萄糖和阿拉伯糖次之。紅外光譜分析表明LSSP呈現(xiàn)出多糖類物質(zhì)的典型特征吸收峰。

3.2 蓮子皮多糖作為新發(fā)現(xiàn)的天然多糖之一，證實蓮子皮多糖具有較強(qiáng)的DPPH、羥基自由基清除活性和還原能力，可以作為一種潛在的天然抗氧化劑資源，另外對Raw264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)實驗表明，LSSP可通過刺激巨噬細(xì)胞釋放NO和細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）來增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)活性，LSSP可作為一種新型的功能性食品免疫調(diào)節(jié)劑。此研究將為深入研究蓮子皮多糖活性作用機(jī)制及蓮子皮資源開發(fā)提供理論依據(jù)。同時，下一步的研究工作主要集中在對LSSP進(jìn)行進(jìn)一步純化，再詳細(xì)探討其免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白信號通路。