項(xiàng) 琦,姚長洪,謝成林,焦薈璇,冉雯儀,張永奎,李德富

(四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都610065)

隨著全球社會的快速發(fā)展和人口的不斷增加，能源物質(zhì)的供應(yīng)不足和環(huán)境污染等問題隨之發(fā)生，尋找可再生、可持續(xù)且環(huán)境友好的新能源物質(zhì)成為近年來研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。微藻是一類能夠進(jìn)行光合作用的微生物，其生長周期短，光合作用效率高，富含脂類、碳水化合物等儲能物質(zhì)，可以轉(zhuǎn)化為生物柴油、生物乙醇和生物基化學(xué)品。微藻的光合效率是陸生植物的10～50倍，而一些產(chǎn)油微藻的理論生物產(chǎn)油量是陸地植物產(chǎn)油量的10～100倍[1]，因此微藻被認(rèn)為是人類未來新能源和化學(xué)品的潛在可再生原料[2]。微藻油脂和碳水化合物的積累通常發(fā)生在非生物脅迫(高光強(qiáng)、高鹽度、營養(yǎng)鹽限制和重金屬等)條件下[3]。然而這些條件會限制微藻細(xì)胞的生長，進(jìn)而使其儲能物質(zhì)的產(chǎn)量降低[2]。

植物激素是作為化學(xué)信使協(xié)調(diào)高等植物細(xì)胞活動的一類小分子物質(zhì)[4]，在細(xì)胞分裂、生長及組織器官分化等方面調(diào)控植物生長發(fā)育。值得注意的是，植物激素在調(diào)節(jié)植物對廣泛的生物和非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要作用[5-6]。例如，脫落酸通過控制高等植物對H2O和離子的吸收，提高植物對溫度和鹽脅迫的抗性[7]。高等植物的激素系統(tǒng)是由微藻的原有初級代謝系統(tǒng)進(jìn)化而來[8]，而現(xiàn)代高等植物的植物激素生物合成途徑可能起源于古微藻[6]，因此，植物激素對微藻的作用原理可能和植物激素對植物體作用的機(jī)制相似。因此，可以將植物激素用于微藻的培養(yǎng)中，對微藻的生長繁殖和脅迫耐受產(chǎn)生正調(diào)控作用。已有研究表明，添加適量濃度植物激素可以促進(jìn)微藻細(xì)胞分裂、提高光合作用效率、提高藻類生物量并增加油脂、葉綠素及蛋白質(zhì)的含量[6,9-10]。這為在脅迫條件下提高儲能物質(zhì)產(chǎn)量提供了新策略[11]。本文中，筆者就近年來國內(nèi)外利用外源添加植物激素結(jié)合非生物脅迫條件調(diào)控微藻儲能物質(zhì)積累的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并提出未來可能的研究方向。

1 植物激素及其在微藻中的作用機(jī)制

最常見的5種植物激素包括生長素(auxins)、脫落酸(abscisic acid,ABA)、赤霉素(gibberellin,GA)、細(xì)胞分裂素(cytokinin,CK)和乙烯(ethylene,ET)[10]。此外，水楊酸(salicylic acid,SA)、油菜甾醇類物質(zhì)(brassinosteroids,BRs)、茉莉酸類(jasmonates,JAs) 和褪黑素(melatonin,MT)等小分子物質(zhì)也可作為植物激素對微藻生長和生理代謝產(chǎn)生調(diào)控作用[11-13]。各種植物激素對微藻生長和儲能物質(zhì)積累的主要調(diào)控機(jī)制如圖1所示。

1.1 生長素

生長素是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的一種植物激素[13]，具有促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨脹的功能[14]，包括吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-丙酸(IPK)、吲哚-3-乙酰胺(IAM)、吲哚-3-n-丙酸(IPA)、1-萘乙酸(NAA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等[10]。其中，對IAA研究最清楚，IAA可以通過提高微藻光合作用過程中的固碳關(guān)鍵酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)和油脂合成關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的活性，增強(qiáng)微藻的光合作用，促進(jìn)微藻的生長和油脂的積累[15-16]。此外，生長素IAA在氮限制條件下可以誘導(dǎo)抗氧化酶(如超氧化物酶和過氧化氫酶)的表達(dá)，從而減輕藻細(xì)胞所受的氧化脅迫，提高生物質(zhì)產(chǎn)率[15]。

1.2 脫落酸

脫落酸(ABA)的化學(xué)本質(zhì)是15個碳的倍半萜化合物，普遍存在于高等植物中，對藻類生理代謝也具有顯著影響[17]。ABA可以減輕高等植物和微藻面臨環(huán)境壓力所造成的有害影響[18]，產(chǎn)生對逆境的抗性，如抗旱、抗寒、抗病及耐鹽等[13]。 Liu等[19]證明了植物激素ABA能夠提高浮萍淀粉生物合成酶的活性，降低催化淀粉降解酶的活性，促進(jìn)淀粉的積累。趙艷霞等[20]發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，ABA可以調(diào)節(jié)鹽藻(Dunaliellasalina)的代謝，增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，并提高具有抗氧化活性的β-胡蘿卜素和多糖的生物合成，清除過氧化物或自由基，降低氧化脅迫對鹽藻的損害。在干旱脅迫下的雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)中，ABA能夠抑制細(xì)胞的生長，促進(jìn)微藻加速進(jìn)入休眠狀態(tài)，以應(yīng)對環(huán)境壓力。另外，ABA通過刺激類胡蘿卜素的生物合成來增強(qiáng)H.pluvialis對脫水的耐受性，而積累的類胡蘿卜素則進(jìn)一步起到保護(hù)作用，防止氧化應(yīng)激損傷[21]。由此可見，ABA能夠在逆境條件下，幫助微藻進(jìn)入休眠狀態(tài)，應(yīng)對環(huán)境壓力，增強(qiáng)微藻的抗逆性。

圖1 植物激素調(diào)控微藻生長和儲能物質(zhì)積累機(jī)制Fig.1 Schematic map of enhancing mechanisms of phytohormones on growth and energy-storage compounds accumulation in microalgae

1.3 赤霉素

赤霉素(GA)的化學(xué)本質(zhì)屬于貝殼衫烯類化合物，是一種普遍存在于植物體內(nèi)的內(nèi)源性植物激素，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的雙鍵、羥基的位置和數(shù)目不同，可分為GA1～7等最具活性的7種形式[13,22]。在添加外源GA的微藻培養(yǎng)基中，GA能夠縮短細(xì)胞生長的停滯期，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入生長指數(shù)期，刺激色素和蛋白的積累[10]。赤霉素通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)的吸收和利用，特別是通過調(diào)節(jié)碳代謝，對微藻的生長和代謝產(chǎn)生影響[23-24]。在氮限制條件下，GA通過提高小球藻固碳關(guān)鍵酶Rubisco大亞基rbcL基因的表達(dá)，促進(jìn)其光合作用和細(xì)胞生長[16]。GA3通過增加酯酶活性和介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)碳的分布，增強(qiáng)了Chlorellapyrenoidosa的生長和脂質(zhì)積累[24]。GA還能減輕重金屬對微藻的毒性，GA3可以減輕鎘和鉛對C.vulgari的毒性，使其保持細(xì)胞生長和光合作用活性[25]。因此，GA對微藻也具有抗脅迫效果。

1.4 細(xì)胞分裂素

細(xì)胞分裂素(CK)是嘌呤的衍生物，它幾乎參與了植物生長發(fā)育中的所有過程[26]，促進(jìn)植物體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)對環(huán)境的耐受性[10]。在植物組織中，CK包括玉米素(zeatin,Z)、激動素(kinetin,K)和6-BA,其主要存在形式是玉米素，有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)，反式是最活躍且分布最廣的結(jié)構(gòu)[27]，但在微藻中順式是主要的活性形式[28]。CK可以誘導(dǎo)微藻細(xì)胞分裂，增強(qiáng)光合色素積累，提高光合作用效率，從而促進(jìn)生物質(zhì)積累[29-30]。在不利的環(huán)境條件下，CK對微藻的生理活動尤其是光合作用有保護(hù)效果[31]。

1.5 乙烯

乙烯(ET)是僅含2個碳原子的不飽和烴氣體，作為植物激素能夠調(diào)節(jié)植物生長和衰老，并抵御生物(如病蟲害入侵)和非生物脅迫(如高鹽、干旱和寒冷等)[32-33]。微藻細(xì)胞內(nèi)乙烯的生成受光照條件和培養(yǎng)基組成的影響，通常低光強(qiáng)會抑制乙烯的生成，而葡萄糖的添加會刺激胞內(nèi)乙烯的合成[34-35]。乙烯對微藻細(xì)胞的生長和生化物質(zhì)合成的調(diào)控作用與其濃度有較大關(guān)系。外源添加5 mmol/L以內(nèi)的乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)對H.pluvialis的生物質(zhì)積累存在正濃度依賴關(guān)系，而在ACC濃度為1 mmol/L時，蝦青素積累達(dá)到最佳[36]。外源添加乙烯釋放前體乙烯利(ethephon)能促進(jìn)小球藻中α-生育酚和γ-氨基丁酸(GABA)的合成，提高抗氧化能力，從而有利于小球藻生物質(zhì)積累，同時提高飽和脂肪酸的含量[37]。乙烯用于微藻的研究還較少，其作用機(jī)制需要深入研究。

1.6 水楊酸

水楊酸(SA)是植物體內(nèi)合成的酚類化合物，化學(xué)名為鄰羥基苯甲酸[38]，參與調(diào)節(jié)植物體的種子萌發(fā)、細(xì)胞生長、光合作用、固氮和衰老等生理過程[26]，同時誘導(dǎo)植物對非生物脅迫(低溫、鹽度、重金屬和干旱等)產(chǎn)生抗性，對植物體產(chǎn)生保護(hù)作用[39-40]。SA對微藻的調(diào)控作用主要體現(xiàn)在對抗氧化系統(tǒng)的影響方面。SA促進(jìn)H2O2的生成，提高類胡蘿卜素相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)抗氧化物質(zhì)(如蝦青素、β-胡蘿卜素)的積累，且在低光強(qiáng)下效果更加明顯[41-42]。此外，SA還影響微藻的碳流分配。SA可以通過調(diào)整氮代謝、氨基酸代謝、糖酵解、磷酸戊糖途徑和脂肪酸代謝等相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)碳水化合物和蛋白降解，使碳流更多地分配到脂肪酸合成途徑，提高微藻脂質(zhì)積累[12,43]。然而，最近Chu等[5]發(fā)現(xiàn)，SA提高三角褐指藻的三酰甘油(TAG)產(chǎn)量是由于SA促進(jìn)藻細(xì)胞的生長和生物質(zhì)積累所致，而并非直接促進(jìn)TAG的生物合成。關(guān)于SA影響微藻生長和儲能物質(zhì)的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

1.7 其他植物激素

除了上述植物激素外，油菜甾醇類 (BRs)、茉莉酸類(JAs) 和褪黑素(MT)等小分子植物激素也能對微藻生理代謝產(chǎn)生影響。油菜甾醇類(BRs)分子可以調(diào)節(jié)微藻細(xì)胞分裂和細(xì)胞延長，提高細(xì)胞抗氧化能力，促進(jìn)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收并合成生長所需的蛋白質(zhì)、核酸、糖類和光合色素[44-46]。此外，BRs在微藻抗非生物脅迫(如重金屬、高/低溫、高鹽等)過程中發(fā)揮重要作用[47-48]。BRs還能與其他植物激素如生長素協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)胞分裂和代謝物的合成[49]。

茉莉酸類(JAs)植物激素分子主要包括茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MJ)，主要參與微藻非生物脅迫下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[50]。與SA類似，JAs能提高微藻類胡蘿卜素相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)抗氧化物質(zhì)如蝦青素、β-胡蘿卜素的積累[51]。

褪黑素(MT)是一種天然的抗氧化劑，其不僅能直接減輕微藻所受高光和氮缺乏導(dǎo)致的氧化脅迫，還能激活微藻的抗氧化系統(tǒng)，促進(jìn)抗氧化分子(如蝦青素)的合成，提高微藻的生物量和油脂積累[50,52]。綜上，目前研究的大多數(shù)植物激素能夠直接或間接地參與微藻細(xì)胞的抗氧化脅迫等生理過程，從而提高脅迫條件下微藻的生物質(zhì)和儲能物質(zhì)的積累。

2 植物激素調(diào)控微藻生長和儲能物質(zhì)積累的應(yīng)用

微藻儲能物質(zhì)(脂質(zhì)和碳水化合物)積累主要是由環(huán)境應(yīng)激條件(如非生物脅迫)導(dǎo)致[53]。這些環(huán)境應(yīng)激條件包括物理刺激(如溫度、 pH、光照強(qiáng)度和鹽度等)和化學(xué)刺激(如缺氮、缺硫或缺磷等營養(yǎng)鹽限制)[54]。營養(yǎng)鹽限制由于其高效性，是微藻積累儲能物質(zhì)常用的一種策略。然而，由于微藻在脅迫環(huán)境中生長受到限制，導(dǎo)致生物量的積累降低，儲能物質(zhì)的產(chǎn)量因此也受到影響。近年來，利用外源添加植物激素抵抗環(huán)境應(yīng)激條件帶來的氧化脅迫、改善微藻細(xì)胞生長和儲能物質(zhì)積累的研究逐漸興起，并發(fā)展了相關(guān)培養(yǎng)工藝和策略，使得生物量和儲能物質(zhì)產(chǎn)量的同時提升成為可能(表1)。

2.1 氮限制條件

氮(N)元素是微藻細(xì)胞合成核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)和葉綠素等生物功能分子的必需元素。N的缺乏會導(dǎo)致微藻細(xì)胞生長減緩、光合作用效率下降、蛋白質(zhì)和葉綠素合成減弱甚至降解，細(xì)胞將光合作用固定的碳源更多地用于儲能物質(zhì)(油脂或碳水化合物)的積累，同時生物質(zhì)的積累受到限制[3,55]。利用植物激素可以減輕N限制帶來的氧化脅迫，提高N限制下的微藻細(xì)胞生長和儲能物質(zhì)積累。Babu等[15]通過在N限制(對照組N濃度的50%)條件下添加1.0×10-5mol/L的生長素IAA，使得Chlorellasorokiniana的生物質(zhì)產(chǎn)率從166 mg/(L·d)增加到201 mg/(L·d)，同時油脂產(chǎn)率從32 mg/(L·d)上升到69 mg/(L·d)。在N限制下，向Acutodesmusobliquus培養(yǎng)液中添加細(xì)胞分裂素kinetin (1.0 mg/L)和Z (0.1 mg/L)，使生物質(zhì)產(chǎn)率分別提高了50.0%和60.7%，同時油脂產(chǎn)率分別提高了65%和63%，油脂和碳水化合物含量也明顯提高[56]。在缺氮條件下，Zhao等[52]添加褪黑素(MT)，使Monoraphidiumsp.QLY-1的油脂含量達(dá)到51.38%，是不添加MT對照組的1.22倍，生物質(zhì)產(chǎn)量也明顯高于不添加MT的對照組。筆者在氮限制條件下加入100 μmol/L 水楊酸(SA)培養(yǎng)亞心形四爿藻(Tetraselmissubcordiformis)，其淀粉含量最高達(dá)到52%，比未添加SA的對照組高37%，淀粉產(chǎn)量和產(chǎn)率分別比對照組高19%和20%(未發(fā)表數(shù)據(jù))，證明添加植物激素在調(diào)控產(chǎn)糖微藻的碳水化合物積累方面也具有較好效果。

表1 植物激素調(diào)控微藻生物質(zhì)和儲能物質(zhì)積累

2.2 其他脅迫條件

鹽度是影響微藻生長的重要環(huán)境因子，對微藻的滲透壓以及膜的通透性有重要影響。鹽度的改變會導(dǎo)致微藻細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài)，影響微藻的生物質(zhì)積累并引起細(xì)胞生化成分的變化[57]。利用植物激素可以減輕高鹽或高滲透條件對微藻造成的氧化脅迫，促進(jìn)生物質(zhì)和儲能物質(zhì)積累。例如，在高鹽(0.1 mol/L NaCl)或高滲透(0.4 mol/L山梨醇)環(huán)境下，ABA可以降低Chlamydomonasreinhardtii胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平，提高抗氧化酶活性，促進(jìn)其細(xì)胞生長[58]。此外，植物激素還可以減輕重金屬和高氨氮等環(huán)境對藻細(xì)胞的毒害作用，從而提高生物質(zhì)產(chǎn)量。例如，細(xì)胞分裂素kinetin可以誘導(dǎo)處于鉻脅迫下的Nostocmuscorum抗氧化酶活性，抑制呼吸作用，從而降低氧化脅迫，提高光合活性，促進(jìn)生物質(zhì)積累[59]。IAA、Z和BR均可以提升高氨氮脅迫下Tetraselmiscordiformis的抗氧化能力和光合活性，從而使生物質(zhì)產(chǎn)量提高近35%[60]。

2.3 多種植物激素聯(lián)合使用

單一使用某種植物激素，對微藻產(chǎn)生的影響不僅有正面作用，同時也可能存在負(fù)面影響。例如，ABA能夠增強(qiáng)微藻對脅迫的耐受性，同時ABA是一種生長抑制劑[10]。聯(lián)合使用多種植物激素可以彌補(bǔ)單一植物激素帶來的負(fù)面影響，產(chǎn)生優(yōu)勢互補(bǔ)效應(yīng)。比如，CK往往能夠激發(fā)微藻細(xì)胞的周期進(jìn)程，促進(jìn)藻細(xì)胞的生長[10]。CK的這一特點(diǎn)可以彌補(bǔ)ABA是生長抑制劑的缺點(diǎn)。所以ABA和CK在細(xì)胞生物合成的協(xié)調(diào)中起著復(fù)雜的交互作用，以響應(yīng)微藻面臨的不利環(huán)境因素[61]。在缺氮條件下，將Z(0.5 mg/L)、IAA(1 mg/L)、GA(5 mg/L) 同時添加到富油柵藻(Acutodesmusobliquus)的培養(yǎng)基中，脂質(zhì)、糖的含量、產(chǎn)率與對照組相比均有提高[62]。14 mg/L 的MJ、6 mg/L的ABA和2 mg/L的SA混合使用，使三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的TAG產(chǎn)率達(dá)到6.83 mg/(L·d)，是對照組的2.41倍[5]。油菜素內(nèi)酯 (BL) + IAA能夠明顯促進(jìn)Chlorellavulgaris積累更多的葉綠素、蛋白質(zhì)和單糖[49]。NAA+GA3與NAA+Z處理Chlorellavulgaris培養(yǎng)液，與對照組相比，生物質(zhì)產(chǎn)量分別提升了138%和136%[63]。因此，多種植物激素聯(lián)合使用，可以促進(jìn)微藻生物質(zhì)積累。

3 總結(jié)與展望

外源植物激素和非生物脅迫條件相結(jié)合，可能實(shí)現(xiàn)微藻生物量和儲能物質(zhì)產(chǎn)量的同步提高。植物激素主要通過減輕氧化脅迫而發(fā)揮正調(diào)控作用。目前關(guān)于添加植物激素調(diào)控微藻儲能物質(zhì)積累的研究主要集中于氮限制條件下的產(chǎn)油微藻(Scenedesmussp.、A￣c￣u￣t￣o￣d￣e￣s￣m￣u￣sobliquus、Monoraphidiusp.QLY-1和Acutodesmusobliquus等)，其余有效的脅迫條件(如缺磷、缺硫和高光等)和產(chǎn)糖微藻涉及很少。此外，目前植物激素對微藻的調(diào)控作用機(jī)制尚不完全清楚，并且缺乏對于微藻內(nèi)源性植物激素的研究。另外，由于植物激素價格昂貴,添加植物激素可能增加微藻儲能物質(zhì)的生產(chǎn)成本。因此，未來的研究重點(diǎn)可能將集中于這三方面：①深入研究具有正調(diào)控作用的植物激素對微藻儲能物質(zhì)代謝調(diào)控的分子機(jī)制。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，利用多組學(xué)(如轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組、相互作用組)聯(lián)合分析，系統(tǒng)研究植物激素刺激下微藻細(xì)胞代謝過程的響應(yīng)和調(diào)控機(jī)制，將為利用代謝工程和合成生物學(xué)手段進(jìn)一步提升儲能物質(zhì)生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。②在更廣泛的范圍內(nèi)篩選更有效且廉價的植物激素，在更多的有效脅迫條件(如缺磷、缺硫或高光等)下應(yīng)用于更多種屬的產(chǎn)糖和產(chǎn)油微藻儲能物質(zhì)代謝調(diào)控。③在培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)模式上優(yōu)化植物激素的添加策略，并進(jìn)行技術(shù)經(jīng)濟(jì)分析，使其最大限度地發(fā)揮提升微藻儲能物質(zhì)產(chǎn)量的作用，同時控制生產(chǎn)成本。