王勇

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

牛欄山酒廠優(yōu)良釀酒酵母的篩選及鑒定

王勇

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

白酒的發(fā)酵過程主要是酒精發(fā)酵和風(fēng)味物質(zhì)形成的過程。在白酒生產(chǎn)中，酒精發(fā)酵過程主要是由釀酒酵母通過糖酵解途徑，將發(fā)酵中的糖類分解為二氧化碳和酒精，在生成酒精的同時(shí)，釀酒酵母還能夠生成多種有機(jī)酸、高級(jí)醇及酯類物質(zhì)，這些物質(zhì)在基酒的風(fēng)味中發(fā)揮重要作用。優(yōu)良性狀的釀酒酵母可以起到提高出酒率，增加風(fēng)味物質(zhì)含量，節(jié)約糧食的目的。牛欄山酒廠針對(duì)特定工藝，對(duì)大曲及發(fā)酵過程中微生物進(jìn)行分離鑒定，獲得20株釀酒酵母菌，并結(jié)合生化性能篩選實(shí)驗(yàn)，最終篩選出產(chǎn)酒精能力、耐酒精能力、發(fā)酵力以及發(fā)酵產(chǎn)物方面較為優(yōu)秀的釀酒酵母菌2株，命名為Y006和Y008。將2株釀酒酵母菌分別制作成強(qiáng)化麩曲添加到釀酒生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中，均起到了增加乙酸乙酯，適量控制乳酸乙酯，降低雜醇油含量且提高出酒率的作用。

微生物；產(chǎn)酒精能力；耐酒精能力；釀酒酵母

在白酒生產(chǎn)中，酒精發(fā)酵過程主要是由釀酒酵母完成的，優(yōu)良的釀酒酵母可以起到提高出酒率、改善基酒質(zhì)量、節(jié)約糧食的作用。白酒生產(chǎn)中要求優(yōu)良的釀酒酵母往往需要具有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力、較高的耐酒精能力，而且會(huì)給成品酒帶來優(yōu)良的風(fēng)味[1]。根據(jù)以上要求，以牛欄山酒廠生產(chǎn)用大曲和酒醅為材料，分離出釀酒酵母菌20株，并進(jìn)行了耐酒精能力、產(chǎn)酒精能力以及發(fā)酵力和發(fā)酵產(chǎn)物等多方面的測(cè)定。綜合分析，最終篩選出生化性能優(yōu)良的釀酒酵母菌2株，并利用其進(jìn)行麩曲強(qiáng)化添加實(shí)驗(yàn)，取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離純化用培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

1.1.2 TTC培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基：TTC0.5 g、葡萄糖5 g、瓊脂15 g、水1000m L。

TTC下層培養(yǎng)基：YPD瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.3 耐酒精性能篩選培養(yǎng)基

含8%vol～30%vol乙醇的8°麥芽汁培養(yǎng)基：試管內(nèi)裝入10m L滅菌的麥芽汁液體培養(yǎng)基，冷卻后加入無水乙醇制成酒精度為8%vol、10%vol、12%vol……28%vol、30%vol的8°麥芽汁培養(yǎng)基。

1.1.4 高粱糖化液培養(yǎng)基

高粱粉碎后按高粱∶水=1∶8的比例混勻后，90℃水浴下糊化90m in，冷卻到60℃，加入糖化酶，糖化2～3 h，煮沸5m in，雙層紗布過濾，按體積加入30 g/100m L葡萄糖。

1.2 酵母的分離純化及PCR鑒定

1.2.1 酵母菌分離

分別取清香型大曲及入池酒醅1 g，用9m L無菌水稀釋，擬定為10-1的濃度。依次稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度，分別吸取10-4、10-5稀釋液0.1m L，接種到麥芽汁培養(yǎng)基平板中，用涂布棒均勻涂布。恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3 d，肉眼觀察培養(yǎng)基平板，根據(jù)釀酒酵母形態(tài)特征，隨機(jī)挑選生長形態(tài)呈圓形、乳白色、菌落平坦稍凸起、有濕潤感、光滑、邊緣整齊的單菌落接入到新的麥芽汁培養(yǎng)基平板中，28℃培養(yǎng)3 d后觀察菌種是否已純化徹底，若不純則按上述方法重新純化直至出現(xiàn)單一菌種。

1.2.2 釀酒酵母鑒定

挑取少量活化的酵母菌體，于滅過菌的1.5m L離心管內(nèi)；加入100μL裂解液（100mM Tris，30mM EDTA，0.5%SDS，pH 8.0，15 Pa滅菌30m in備用）；100℃水浴15m in；加入100μL 2.5M的醋酸鉀溶液，冰浴60m in；4℃下13000 r/m in離心5m in，取上清液200μL至0.5m L離心管中；加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），劇烈振蕩10m in，13000 r/m in離心15min，移取100μL上清液至0.5m L離心管中；加入100μL預(yù)冷的異丙醇，混勻后于-20℃下放置20m in；13000 r/m in離心15m in，棄上清液；用70%的酒精洗滌沉淀2次；沉淀過夜自然干燥；加入50μL已滅菌的超純水，室溫下溶解1 h，-20℃冰箱儲(chǔ)藏備用。PCR擴(kuò)增酵母菌D1/D2區(qū)，所用引物及PCR條件見表1。

表1 酵母菌D1/D2區(qū)擴(kuò)增引物及PCR反應(yīng)條件

PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序后，用Chromas軟件分析測(cè)序質(zhì)量，去除峰圖不可靠的部分對(duì)DNA序列進(jìn)行手動(dòng)校正，用校正后的序列在NCBI（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進(jìn)行同源序列搜索，比較該菌株在D1/D2序列上親緣關(guān)系最近的已知酵母菌信息，包括模式菌株與實(shí)驗(yàn)菌株的堿基差異，近緣模式菌株GenBank序列號(hào)。目前所有已知酵母菌的核糖體D1/D2和ITS序列都已上傳至數(shù)據(jù)庫中，可在線搜索。因此，可以根據(jù)序列同源性初步判斷待測(cè)菌株的分類地位。

表2 釀酒酵母鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中共分離到疑似釀酒酵母35株，通過PCR鑒定后，確定釀酒酵母菌20株，編號(hào)為Y001—Y020（見表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的理化篩選實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 酵母TTC顯色實(shí)驗(yàn)

將上述分離出的20株釀酒酵母菌分別接種到TTC顯色培養(yǎng)基中，比較顏色深淺，作為其性能的參考，結(jié)果見表3。

結(jié)果分析：TTC顯色劑對(duì)酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過它可以判斷酵母中酶活力的大小，即酵母產(chǎn)酒精能力的強(qiáng)弱。產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌菌落呈深紅色，次之為粉紅色，野生酵母呈紅色或粉紅色，通過TTC顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，Y010、Y002、Y008、Y006、Y020為黑紫紅色，顏色最深，初步推斷出是產(chǎn)酒精能力最高的，可作為優(yōu)良釀酒酵母篩選的參考依據(jù)。

表3 酵母菌株TTC顯色實(shí)驗(yàn)

2.1.2 耐酒精性能篩選

將20株釀酒酵母分別接入含8%vol～30%vol乙醇的麥芽汁中，28℃條件下培養(yǎng)60 h，分別在12 h、24 h、48 h和72 h時(shí)觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，結(jié)果見圖1。

圖1 耐酒精度實(shí)驗(yàn)

結(jié)果分析：雖然酒精是釀酒酵母的主要產(chǎn)物，但較高的酒精對(duì)酵母的生長依然起到一定的抑制作用。而在白酒發(fā)酵環(huán)境中，酒精的存在是不可避免的，所以具有較高耐酒精能力的釀酒酵母菌才能在發(fā)酵過程中生長良好。由耐酒精度實(shí)驗(yàn)柱狀圖可以看出，Y020耐酒精能力最強(qiáng)，達(dá)到20%vol，此外Y001、Y006、Y008、Y014也相對(duì)較強(qiáng)。

2.1.3 釀酒酵母發(fā)酵性能測(cè)定

將純化好的釀酒酵母入到帶發(fā)酵栓并含有100m L高粱糖化醪的150m L三角瓶中，發(fā)酵栓中裝入10m L、5mol/L的硫酸阻止水分蒸發(fā)，28℃培養(yǎng)，每日稱重，記錄每日失重情況，待發(fā)酵結(jié)束時(shí)計(jì)算總失重，并測(cè)定其酒精含量，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 菌株發(fā)酵失重圖

圖3 菌株產(chǎn)酒精圖

結(jié)果分析：通過菌種發(fā)酵失重圖和產(chǎn)酒精實(shí)驗(yàn)圖看出，Y006、Y008、Y020這3株酵母在失重實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)酒精實(shí)驗(yàn)中數(shù)值均較高。

分析總結(jié)：通過TTC顯色實(shí)驗(yàn)挑選出顏色最深的5株酵母為Y010、Y002、Y008、Y006、Y020。在耐酒精度實(shí)驗(yàn)中Y020為最高值22%vol，Y008為20%vol，Y001、Y006、Y014介于12%vol和16%vol之間。通過以上生化性能篩選實(shí)驗(yàn)確定Y006、Y008、Y020為初期優(yōu)良釀酒酵母，將此3株菌種進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析以挑選最優(yōu)菌株。

2.1.4 酵母產(chǎn)酯能力的測(cè)定

酯類是一類具有芳香性氣味的化合物，多數(shù)呈果香，是白酒中重要的芳香物質(zhì)，可在不同程度上賦予酒的香氣，并決定香氣的品質(zhì)。

將Y006、Y008、Y020分別挑取1～2環(huán)加入到100m L麥芽汁液體培養(yǎng)基中，裝好發(fā)酵栓，塞緊膠塞，用滴管向發(fā)酵栓內(nèi)加入5mol/L硫酸，直至液面距發(fā)酵栓上出氣口1 cm為止。置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，每天搖勻稱重，直至恒重。將產(chǎn)酯培養(yǎng)后恒重的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入500 m L平底燒瓶中，加入100m L、60%vol乙醇進(jìn)行蒸餾，收集100m L餾分，氣相色譜儀分析測(cè)定。選取普遍使用的商業(yè)用釀酒酵母作為對(duì)照參考，見表4。

表4 酵母代謝產(chǎn)物測(cè)定(mg/100 mL)

結(jié)果分析：從各菌株所產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)來看，主要代謝產(chǎn)物為正丙醇、異戊醇、異丁醇、活性戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯等。在清香型白酒中，乙酸乙酯賦予清香型白酒主體風(fēng)味，Y006和Y008在產(chǎn)乙酸乙酯方面同對(duì)照相比提高了23.84%和30.38%；而影響白酒風(fēng)味的主要雜醇油為正丙醇、異丁醇、異戊醇等，同對(duì)照相比，Y006、Y008產(chǎn)異丁醇分別降低了77.67%和60.57%，產(chǎn)異戊醇分別降低了62.59%和66.27%。由表4可看出，Y006、Y008均起到了增加乙酸乙酯，降低雜醇油的作用。

通過TTC顯色實(shí)驗(yàn)、耐酒精度、菌種發(fā)酵失重、產(chǎn)酒精量和產(chǎn)酯產(chǎn)香及雜醇油產(chǎn)量測(cè)定，我們將菌株Y006、Y008確定為今后實(shí)驗(yàn)選用的優(yōu)良釀酒酵母菌。

2.2 麩曲的制作

強(qiáng)化麩曲配方：麩皮65%，水35%，攪拌均勻，裝入三角瓶中，121℃滅菌30m in。

將純化的酵母斜面試管菌種取1環(huán)，接種到三角瓶中，28℃培養(yǎng)3 d。取出放入40℃烘干箱中烘干備用。

2.3 強(qiáng)化麩曲添加實(shí)驗(yàn)

將強(qiáng)化麩曲按投糧比例的3‰分別添加到大曲中拌勻，與大曲混合使用，其余按照清茬大曲釀酒工藝。蒸餾后得到的基酒分別稱為Y006基酒、Y008基酒，將不添加強(qiáng)化麩曲的普通工藝的基酒稱為對(duì)照基酒[4-5]。分別計(jì)算出酒率，并將3種基酒分別降度至60%vol，氣相色譜測(cè)定基酒骨架成分，結(jié)果見表5。

表5 基酒色譜骨架成分(mg/100 mL)

從表5可以看出，Y006基酒與Y008基酒同對(duì)照相比：在總酯和乙酯含量較對(duì)照基酒有不同程度提高。乙酸乙酯含量提高11.00%和39.31%，乳酸乙酯降低15.54%和5.55%，正丙醇含量略有上升，而異丁醇和異戊醇含量有較大幅度下降。出酒率見表6。

表6 添加強(qiáng)化麩曲實(shí)驗(yàn)的出酒率

在原糧出酒率方面，添加強(qiáng)化麩曲的出酒率要高于不添加強(qiáng)化麩曲的出酒率，與對(duì)照基酒相比，Y006強(qiáng)化麩曲基酒出酒率提高了4.78%，Y008強(qiáng)化麩曲基酒出酒率提高了7.95%。

白酒釀造過程中的酵母主要分為釀酒酵母、產(chǎn)酯酵母以及酵母屬的其他微生物，以牛欄山酒廠生產(chǎn)用清香大曲及酒醅為材料分離出釀酒酵母20株。分別進(jìn)行了TTC顯色實(shí)驗(yàn)，耐酒精能力、發(fā)酵能力和酒精產(chǎn)量的測(cè)定。綜合考慮，挑選出Y006、Y008、Y020為初期優(yōu)良釀酒酵母，隨后對(duì)其進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析。與市售商業(yè)釀酒酵母相比，Y006、Y008具有高產(chǎn)乙酸乙酯，同時(shí)適當(dāng)降低雜醇油含量的能力，最終將Y006、Y008確定為優(yōu)秀釀酒酵母菌株，并制作成強(qiáng)化麩曲添加到釀酒實(shí)驗(yàn)中去。從基酒色譜分析及出酒率統(tǒng)計(jì)可以看出，添加Y006、Y008釀酒酵母進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，有效提高基酒出酒率4.7%～7.9%，每班次全年可增產(chǎn)基酒6.6 t，為企業(yè)帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)，通過強(qiáng)化菌種應(yīng)用可適當(dāng)提高基酒乙酸乙酯含量，降低乳酸乙酯含量，適量降低雜醇油含量，起到協(xié)調(diào)酒體，改善酒質(zhì)的作用，提高了優(yōu)質(zhì)酒率。

3 討論

釀酒酵母作為發(fā)酵中眾多微生物的一種，在白酒的產(chǎn)酒和產(chǎn)香方面具有重要作用。根據(jù)釀酒酵母的理化性能及代謝產(chǎn)物差異，可以簡便有效的篩選出優(yōu)良菌株，并利用強(qiáng)化麩曲的添加方式進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，達(dá)到改善基酒質(zhì)量，提高基酒產(chǎn)量的目的。總體而言，優(yōu)良的釀酒酵母可以起到提高出酒率和優(yōu)質(zhì)酒率，節(jié)約糧食，降低原酒成本的作用，在白酒企業(yè)中具有較高的應(yīng)用前景。

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Screening and Identification of Quality S.cerevisiae Strains in Niulanshan Distillery

WANG Yong
(Niulanshan Distillery,Beijing 101301,China)

Liquor fermentation is the process of alcoholic fermentation and the formation of flavoring substances.In alcoholic fermentation,sugar is decomposed into carbon dioxide and alcohol through glycolysis by S.cerevisiae.At the same time,a variety of organic acids,higher alcohols and ester compounds are produced.Those substances play important roles in base liquor flavor.It can be concluded that S.cerevisiae strainsw ith excellentperformance are capable of enhancing liquor yield,increasing flavoring compounds content,and saving grains.In this study,20 S.cerevisiae strains were isolated in Niulanshan Distillery.Through biochem ical property screening test,two S.cerevisiae strainsw ith excellent alcohol-producing capability,alcohohol resistance,fermenting power and fermenting productswere finally obtained and they were named Y006 and Y008.The two strainswere used for the preparation of Fuqu and then used respectively in liquor-making,which could increase ethylacetate,controlethyl lactate properly,reduce fusel oil,and increase liquor yield.

microbe;alcohol-producing capability;alcohol resistance;S.cerevisiae

TS262.3；TS261.1；TS261.4；Q93-3

A

1001-9286（2017）04-0061-04

10.13746/j.njkj.2017048

2017-03-03

王勇(1982-)，碩士，高級(jí)工程師，國家級(jí)白酒評(píng)酒委員。