李記彬　胡秀芬　劉放　宋純

[摘要]目的：研究細(xì)胞角蛋白19mRNA檢測(cè)在大腸癌（CRC）患者外周血轉(zhuǎn)移診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法：選取我院2011年2月至2014年3月大腸癌患者共計(jì)126例進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，另選40例大腸良性疾病患者與40例健康獻(xiàn)血者進(jìn)行對(duì)照，采取熒光定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-RT-PCR）測(cè)定其CK19mRNA含量。并分析CK19mRNA在腫瘤回流血中的表達(dá)。結(jié)果：40例健康者1例CK19mRNA陽性表達(dá)，40例結(jié)腸良性疾病患者均為陰性；126例患者CKl9陽性例數(shù)74例，陽性表達(dá)率為58.73%，與健康組和良性組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CK19陽性表達(dá)與性別、年齡、細(xì)胞分化類型無明顯相關(guān)（P>0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性（P<0.05），同時(shí)Dukes分期C、D期患者陽性檢出率明顯高于A、B期患者（P<0.05）。結(jié)論：CKl9mRNA檢測(cè)應(yīng)用于大腸癌患者外周血轉(zhuǎn)移診斷有較高的價(jià)值，可以為腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)診斷提供重要依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]細(xì)胞角蛋白19；大腸癌；外周血轉(zhuǎn)移；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：R735.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）01-055-02

細(xì)胞角蛋白（CK）屬于多基因家族，包含有20多個(gè)不同亞類分子，主要表達(dá)集中在上皮細(xì)胞，同時(shí)可以不斷分泌進(jìn)入到外周血中，因此可以將外周血特異性上皮性基因的異常表達(dá)作為檢測(cè)上皮性惡性腫瘤細(xì)胞的重要指標(biāo)。CK20mRNA已成為膀胱癌、乳腺癌、大腸癌的血行轉(zhuǎn)移依據(jù)，本次研究主要圍繞大腸癌患者外周血轉(zhuǎn)移診斷中CK19mRNA的表達(dá)，分析其對(duì)大腸癌轉(zhuǎn)移診斷的臨床意義。

1.資料與方法

1.1一般資料

研究選取的126例大腸癌患者均為2011年2月至2014年3月在我院接受住院治療的病例，其中男性占84例，女性42例，年齡范圍32～84歲，平均年齡（57.9±3.2）歲，Dukes分期：A期30例、B期26例、C期48例、D期22例；細(xì)胞分化程度：高分化36例、中分化64例、低分化26例；組織學(xué)類型：結(jié)腸癌72例，直腸癌52例。同時(shí)選取40例健康獻(xiàn)血者（健康組）和40例結(jié)腸良性疾病患者（良性疾病組）進(jìn)行對(duì)比。健康組：男性20例，女性20例，年齡范圍29-70歲，平均年齡（48.7±3.3）歲；良性疾病組：男性20例，女性20例，年齡范圍30-72歲，平均年齡（50.1±2.9）歲。三組患者性別、年齡等基線資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2一般方法

1.2.1RNA提取 分別抽取大腸癌患者、健康志愿者及結(jié)腸良性疾病患者外周靜脈血5mL，并采用枸櫞酸鈉抗凝，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞采取淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，保存到離心管，持續(xù)5min離心每分鐘12000r，然后將Trizol lmL加入并使其均勻，后加200μL氯仿并混勻，離心15min，每分鐘12000r，吸取上清放置到離心管中加入500μL異丙醇混合均勻，離心10min，每分鐘12000r，然后使用75%乙醇進(jìn)行1次漂洗，放置待干，添入DEPC水30μL，對(duì)RNA進(jìn)行溶解，同時(shí)依靠紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA的純度以及濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA與PCR擴(kuò)增 取總RNA于70℃變性5min后沐浴，根據(jù)每個(gè)反應(yīng)將RT反應(yīng)液18μL逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）1μL（5U/μL），RNA酶抑制劑（RNasin）1μL（40U/μL），將變性RNA5μL加入，水浴30min，溫度37℃，95℃變性5min。PCR擴(kuò)增根據(jù)每個(gè)反應(yīng)將43μL反應(yīng)液加入，Taq酶2μL（5U/μL），RT反應(yīng)產(chǎn)物5μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性為95℃ 5min，95℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 20s，40個(gè)循環(huán)。72%延伸10min。同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)eDNA為陽性對(duì)照，無菌水為陰性對(duì)照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用x2檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1健康組、結(jié)腸良性組外周血CK19mRNA表達(dá)

40例健康者1例CK19mRNA陽性表達(dá)，40例結(jié)腸良性疾病患者均為陰性。

2.2大腸癌組外周血CK19mRNA表達(dá)

126例患者CK19陽性例數(shù)74例，陽性表達(dá)率為58.73%，與健康組和良性組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3CK19 mRNA陽性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

CRC中CK19 mRNA陽性表達(dá)與性別、年齡、細(xì)胞分化類型無明顯相關(guān)（P>0.05），陽性率與Dukes分期，分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）見表1。

3.討論

大腸癌患者死亡的主要原因是大腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，而盡早對(duì)大腸癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行診斷是關(guān)鍵所在。CKl9在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，目前已成為研究熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落是血液循環(huán)開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的先兆，當(dāng)腫瘤原發(fā)灶開始成熟后，腫瘤細(xì)胞才會(huì)開始轉(zhuǎn)移進(jìn)入到外周血當(dāng)中，人體免疫系統(tǒng)能夠清除大多數(shù)的細(xì)胞，但是仍會(huì)有少量殘留惡性腫瘤細(xì)胞集合成為癌細(xì)胞團(tuán)，最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)移灶，循環(huán)血中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量不多，因此需要高特異性和敏感度的檢測(cè)方式。PCR技術(shù)很好地解決了這一問題。RT-PCR可在106-107個(gè)正常細(xì)胞中檢測(cè)出癌細(xì)胞，目前在眾多腫瘤標(biāo)志物的研究中均有廣泛的應(yīng)用。FQ-RT-PCR是在RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的mRNA定量方法，具有靈敏度、特異性高、效率高、污染小等優(yōu)勢(shì)。

本研究應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)外周血中CK19表達(dá)，結(jié)果健康體檢者中出現(xiàn)1例陽性表達(dá)者，原因有待進(jìn)一步研究，良性組均無陽性表達(dá)。顯示126例外周血CK19mRNA陽性檢出率為58.73%。相關(guān)性分析可見Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與外周血中CK19表達(dá)率相關(guān)。C、D期的陽性檢出率明顯高于A、B期，提示C、D期大腸癌預(yù)后不良，并存在較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，CK19 mRNA在CRC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。CK19mRNA檢測(cè)應(yīng)用于CRC患者外周血轉(zhuǎn)移診斷有較高的價(jià)值，可以為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供重要診斷依據(jù)。