劉文強(qiáng)，秦緒嶺，蘇建青，江 成，王守山，路建彪

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城252059）

偽狂犬病病毒（peudorabies virus，PRV）是引起牛、羊、豬、兔、犬和貓等多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒。PRV在豬群中的發(fā)生較為普遍，兔通常作為人工感染的試驗(yàn)動(dòng)物，但是PRV在兔場(chǎng)自然感染發(fā)病并造成種兔繁殖障礙的病例則未見(jiàn)報(bào)道。2011年山東省西部4家獺兔場(chǎng)在1月內(nèi)連續(xù)發(fā)生以懷孕母兔流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎為主的疫病。個(gè)別母兔和仔兔出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后死亡。對(duì)其進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查和血清學(xué)鑒定。從胎兒腦及內(nèi)臟組織中分離到多株病毒，對(duì)其中1株進(jìn)行了初步鑒定。結(jié)果表明，所分離病毒為偽狂犬病病毒。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況 4家獺兔養(yǎng)殖場(chǎng)，1月內(nèi)母兔流產(chǎn)率超過(guò)26%（33／126）。流產(chǎn)以木乃伊胎和死胎為主，極個(gè)別產(chǎn)下弱仔，48h內(nèi)死亡。33只流產(chǎn)母兔有4只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為尖叫、轉(zhuǎn)圈、麻痹、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、口吐白沫，大多數(shù)母兔無(wú)明顯癥狀，病死兔剖檢無(wú)明顯病變，少數(shù)家兔的病變包括腎臟少量針尖大出血點(diǎn)，腦膜明顯充血，腦脊髓液增多，肝、脾少量大小不等的灰白色壞死點(diǎn)，有的病例可見(jiàn)肺充血、水腫。

1.2 診斷 對(duì)發(fā)病種兔無(wú)菌采集血液并分離血清，分別使用偽狂犬病乳膠凝集抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及陰性血清（科前公司）、沙門(mén)菌平板凝集抗原（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）、布魯菌虎紅平板凝集抗原（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）檢測(cè)發(fā)病后抗體情況；使用gEELISA（科前公司）檢測(cè)采集的血清樣品。采集發(fā)病兔腦組織、肝臟和腎臟等制備病料懸液，檢測(cè)兔瘟病毒、巴氏桿菌和沙門(mén)菌。對(duì)病料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查：取病兔肝、脾、肺、腎、腦、淋巴結(jié)組織觸片，革蘭染色鏡檢；同時(shí)將以上病料接種于胰酶大豆肉湯和厭氧肝湯，置于37℃培養(yǎng)5d。

1.3 材料

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚、家兔及小鼠，分別購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房和聊城大學(xué)動(dòng)物生態(tài)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室等，經(jīng)偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)檢驗(yàn)均為陰性。9～11日齡SPF雞胚制備CEF細(xì)胞。

1.3.2 參考病毒株和細(xì)胞 偽狂犬病病毒La株，為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。BHK－21細(xì)胞和Vero細(xì)胞，購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.4 病毒分離 參考文獻(xiàn)介紹的方法處理病料，分別接種到單層PK15細(xì)胞和CEF細(xì)胞，每瓶接種2 mL，每個(gè)樣品接種2瓶，PRV La株作陽(yáng)性對(duì)照。產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）者，繼續(xù)傳代直至其CPE出現(xiàn)時(shí)間穩(wěn)定為止。將CPE典型且出現(xiàn)時(shí)間穩(wěn)定的培養(yǎng)物分別接種于BHK－21細(xì)胞、Vero細(xì)胞，比較其所致 CPE情況［1－2，9］。

1.5 毒株 TCID50滴定 參考文獻(xiàn)［1，2，9］介紹的方法，取克隆毒株在BHK－21細(xì)胞上測(cè)定TCID50。

1.6 克隆毒株理化性質(zhì)鑒定 參考文獻(xiàn)測(cè)定病毒對(duì)乙醚、氯仿、熱的耐受性，并進(jìn)行陽(yáng)離子保護(hù)試驗(yàn)。

1.7 動(dòng)物接種試驗(yàn) 取6只家兔，其中4只腹側(cè)皮下注射病毒細(xì)胞培養(yǎng)液1mL／只（107TCID50），另設(shè)2只家兔注射Hank′s液作對(duì)照，觀察家兔發(fā)病情況。另取12只小鼠，其中10只腹側(cè)皮下注射病毒細(xì)胞培養(yǎng)液0.2mL／只，另2只小鼠注射Hank′s液作對(duì)照。

1.8 中和試驗(yàn) 采用固定血清稀釋病毒法，測(cè)定陽(yáng)性組和對(duì)照組的TCID50，計(jì)算中和指數(shù)。

1.9 病毒特異性的PCR檢測(cè) 根據(jù)已發(fā)表的PRV La株的gE基因的核苷酸序列，根據(jù)已發(fā)表的PRV La株gE基因序列自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見(jiàn)文獻(xiàn)［7－9］。使用該對(duì)引物對(duì)分離病毒進(jìn)行PCR鑒定。使用pMD18－T將其克隆后進(jìn)行序列測(cè)定，使用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析和同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測(cè) 發(fā)病家兔的血清與PRV呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，O型血凝集試驗(yàn)檢測(cè)兔瘟病毒陰性，沙門(mén)菌和布魯菌病抗體檢測(cè)均為陰性。細(xì)菌學(xué)檢查也均為陰性。由表1可知，感染PRV的4家兔場(chǎng)中，不同的檢測(cè)方法的結(jié)果略有差異，但總體上，流產(chǎn)母兔的陽(yáng)性率為71.4%～80.0%，妊娠母兔為45.1%～62.2%，種公兔為27.8%～55.6%，流產(chǎn)仔兔81.3%。

表1 各種家兔感染PRV的檢測(cè)情況

2.2 病毒致CPE結(jié)果 接種細(xì)胞CPE的出現(xiàn)：將病料上清接種于CEF細(xì)胞，均可在第1代觀察到CPE，并且與PRV La株所致病變一致。在Vero細(xì)胞和BHK－21細(xì)胞上，均產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變。在Vero細(xì)胞上出現(xiàn)明顯的細(xì)胞融合和“拉網(wǎng)”現(xiàn)象，出現(xiàn)50%CPE病灶至全部細(xì)胞脫落的時(shí)間很短，而在CEF則不出現(xiàn)“拉網(wǎng)”現(xiàn)象。該病毒在BHK－21細(xì)胞上的細(xì)胞病變?yōu)榧?xì)胞圓縮，折光性增強(qiáng)，病變細(xì)胞與正常細(xì)胞界限清楚，病變細(xì)胞各自獨(dú)立，不發(fā)生融合。與PRV La株的表現(xiàn)一致［9］。

2.3 病毒TCID50測(cè)定 克隆純化病毒在BHK－21細(xì)胞上的滴度，按Reed－Muench法計(jì)算的TCID50＝10－6.18／0.1mL。

2.4 病毒的理化性質(zhì) 與對(duì)照相比，當(dāng)TCID50降低2個(gè)滴度時(shí)，可判為對(duì)理化因素敏感。結(jié)果表明，所分離的病毒對(duì)乙醚、氯仿、熱以及陽(yáng)離子敏感。

2.5 中和試驗(yàn) 分離毒在細(xì)胞上的中和指數(shù)為67，大于50，即PRV陽(yáng)性血清能夠中和分離毒。

2.6 動(dòng)物試驗(yàn) 分離的病毒接種于家兔和小鼠，均產(chǎn)生了典型的偽狂犬病癥狀。4只家兔表現(xiàn)奇癢，最后相繼麻痹死亡，對(duì)照家兔未見(jiàn)異常；小鼠于接種60h后表現(xiàn)被毛雜亂，狂躁不安，啃咬腿跟內(nèi)側(cè)及注射部位，至96h時(shí)死亡8只，另2只麻痹不動(dòng)，對(duì)照動(dòng)物無(wú)異常變化。剖檢見(jiàn)肺嚴(yán)重出血，腦膜輕微充血，肝有少量出血和壞死，其他組織器官無(wú)明顯病變。

2.7 PCR擴(kuò)增 3個(gè)兔體分離毒株和PRV La株（作為陽(yáng)性對(duì)照）均在約1 740bp的同一位置出現(xiàn)1條特異性條帶，而正常BHK－21細(xì)胞和乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)陰性的家兔脾臟（作為陰性對(duì)照）則不能擴(kuò)增出任何條帶（圖1）。該片段送至TaKaRa公司測(cè)序，與結(jié)果表明與PRVLa株gE基因序列（Gen－Bank登記號(hào)：504333）同源性為98.5%。

3 討論

本試驗(yàn)從山東4家兔場(chǎng)的流產(chǎn)母兔中分離到數(shù)株病毒，就其中1株進(jìn)行了詳細(xì)鑒定。從血清學(xué)、病毒學(xué)及核苷酸水平上證實(shí)了所分離的病毒為PRV。

圖1 PRV gE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

家兔流產(chǎn)在家兔飼養(yǎng)過(guò)程中并不多見(jiàn)。排除了兔瘟、沙門(mén)菌及布魯菌病感染情況后，飼料企業(yè)將樣品送到有關(guān)部門(mén)檢驗(yàn)也排除了飼料中毒和真菌毒素污染的可能。通過(guò)血清學(xué)、病毒學(xué)及分子生物學(xué)診斷，本試驗(yàn)證實(shí)了PRV自然感染引起家兔繁殖障礙的病例。我國(guó)自1947年在貓發(fā)現(xiàn)首例偽狂犬病以來(lái)，陸續(xù)有豬、牛、羊、貂、狐、鹿、驢、騾等感染該病的報(bào)道。兔作為PRV研究的易感動(dòng)物，鮮有自然感染而且造成規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)種兔流產(chǎn)的疫情報(bào)道。豬是PRV的原發(fā)感染宿主，可長(zhǎng)期帶毒和排毒［6，8］。PRV兔體自然分離株的特性及部分致病基因片段與在本區(qū)域廣泛流行的PRV La株具有完全相同的特征和同源性?？紤]到PRV的生物學(xué)特性，在該區(qū)域豬、獺兔養(yǎng)殖密度大的情況下，該毒株似乎是豬體內(nèi)的野毒自然感染家兔的結(jié)果，造成家兔產(chǎn)生上述嚴(yán)重癥狀并在兔群中流行，在家兔分娩季節(jié)造成嚴(yán)重的繁殖障礙。以上PRV的流行新特征值得注意。該病發(fā)病急、死亡快，造成流產(chǎn)后損失較大，而且臨床檢查常常見(jiàn)不到明顯的癥狀和病變，給臨床診斷造成很大困難，必須依靠詳細(xì)的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室診斷。

目前我國(guó)已是偽狂犬病流行廣泛的國(guó)家之一，至今尚未徹底清除該病。許多國(guó)家通過(guò)接種基因缺失苗配合gE－ELISA 成功清除了偽狂犬病［3－5］，許多學(xué)者也呼吁在我國(guó)采取相應(yīng)措施清除該病。本文提示，必須充分重視兔偽狂犬病的發(fā)生，密切關(guān)注其流行情況，及時(shí)撲滅及消除PRV感染，否則不能排除兔PRV重新傳染給豬群，會(huì)嚴(yán)重影響該病在養(yǎng)豬場(chǎng)的凈化和根除。

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