許崇利　佘玉罕　付鳳洋　史沁紅　許崇波

摘要：目的 利用PCR和基因定點突變技術(shù)，分別擴增出K88ac、K99、LTB和突變的ST1基因，構(gòu)建了重組菌株BL21（DE3）（pXKKSL4），酶切鑒定和序列分析表明構(gòu)建的pXKKSL4表達(dá)載體包含有K88ac－K99-3ST1-LTB融合基因且閱讀框架正確。方法 SDS－PAGE分析表明融合蛋白占菌體總蛋白含量的35.72%。ELISA檢測證實融合蛋白能與ST1單抗、LTB、K88ac和K99抗體相結(jié)合。結(jié)果 乳鼠灌胃實驗表明K88ac－K99-3ST1-LTB融合蛋白已失去ST1天然毒性，免疫保護試驗表明菌株氫氧化鋁佐劑苗和包涵體粗提物氫氧化鋁佐劑苗均具有良好的免疫效果，其免疫保護率分為98%和96%。結(jié)論 上述研究表明構(gòu)建的四價滅活疫苗不但解決了ST1腸毒素毒性問題，而且又賦予其免疫原性，同時增加K99菌毛可使免疫效果進(jìn)一步增強，這樣從腸毒素和菌毛兩種途徑，達(dá)到預(yù)防由ETEC引起的腹瀉目的，從而有效控制腹瀉的發(fā)生，為將來制備產(chǎn)腸毒素大腸桿菌基因工程滅活疫苗打下堅實基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；滅活疫苗；融合基因；表達(dá)

中圖分類號：S859.797文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Development of a tetravalent genetically engineered inactivated vaccine against

enterotoxigenic Escherichia coli

XU? Chongli1 ，SHE? Yuhan1 ，F(xiàn)U? Fengyang1 ，SHI? Qinhong1 ，XU? Chongbo2*

英文作者單位（1 College of Medical Technology， Chongqing Medical and Pharmaceutical College， Chongqing 401331，China;

2? Henry Fok School of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan，Guangdong 512005，China）

Abstract：? Objective The K88ac， K99， LTB and ST1 genes were respectively amplified by PCR and site－directed mutagenesis and the recombinant strain BL21（DE3）（pXKKSL4） was constructed. Enzyme digestion identification and sequence analysis showed that the constructed pXKKSL4 expression vector contained K88ac－K99-3ST1-LTB fusion gene and the reading frame was correct.Method? The SDS－PAGE analysis showed that the expression level of the fusion proteins were about 35.72% of total cellular protein. ELISA confirmed that the fusion protein could bind to ST1 monoclonal antibody， LTB， K88ac and K99 antibodies. Result? The results of intragastric test of suckling rat showed that the fusion protein had lost the toxicity of natural ST1 enterotoxin. The immune protection test showed that the aluminum hydroxide adjuvant vaccine of strain and crude extract of inclusion body had good immune effect and the immune protection rate was 98% and 96%.Conclusion The above studies indicated that the constructed tetravalent inactivated vaccine not only solved the toxicity problem of ST1 enterotoxin but also gave it immunogenicity. At the same time， K99 pili can further enhance the immune effect.This could prevent diarrhea caused by ETEC through both enterotoxin and fimbrium pathways so as to effectively control the occurrence of diarrhea. It lays a solid foundation for the preparation of enterotoxigenic Escherichia coli genetically engineered inactivated vaccine in the future.

Key words： Enterotoxigenic Escherichia coli;Inactivated vaccine;Fusion gene;Expression

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是一類引起人和幼畜（初生仔豬、犢牛、羔羊及斷奶仔豬）腹瀉的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因劇烈水樣腹瀉和迅速脫水而死亡，發(fā)病率和死亡率均很高。ETEC具有兩類致病因子：一類為腸毒素，另一類為粘著素（或稱定居因子），已知的粘著素主要有K88、K99和K99等。ETEC借助這些粘著素定居于宿主腸道粘膜的上皮細(xì)胞上，從而大量繁殖、產(chǎn)生大量腸毒素，由腸毒素造成腸粘膜上皮細(xì)胞的病理性變化，導(dǎo)致仔豬黃痢。已知來源于豬的ETEC主要粘著素為K88ac，它是導(dǎo)致仔豬黃痢的間接致瀉因子。腸毒素是導(dǎo)致仔豬黃痢的直接致瀉因子，包括耐熱性腸毒素ST和不耐熱腸毒素LT兩種。根據(jù)抗原性及宿主差異，ST又分為ST1和ST2兩類。ST不具有免疫原性。LT由一個分子量為28 kDa的A亞單位結(jié)合五個分子量為11.5 kDa的B亞單位組成，全LT或其B亞單位都具有良好的免疫原性。ETEC致病率達(dá)到20～40%，死亡率甚至高達(dá)30%～50%［1-4］。對于ETEC 引起疾病的治療以藥物和疫苗為主，包括以抗腸毒素免疫為主的的類毒素苗或 LT B 亞單位苗；以抗粘附素免疫為基礎(chǔ)的的含單價或多價粘附素抗原的滅活全菌苗或亞單位苗。如何避免該病帶來的經(jīng)濟損失成為亟待解決的關(guān)鍵問題。目前最有效的措施是采取免疫預(yù)防，然而目前使用的傳統(tǒng)滅活疫苗大多數(shù)存在固有的缺點，且已有的K88-K99和K88ac－LTB基因工程疫苗并沒有解決ST1毒性和免疫原性問題，故而免疫效果并不是十分理想。ST1是引起腹瀉最關(guān)鍵的毒素因子，如果不解決這一重要因素達(dá)不到有效的預(yù)防效果必將帶來巨大經(jīng)濟損失［5-7］。為此課題組針對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌主要毒力因子粘著素K88ac、K99和腸毒素ST1、LTB構(gòu)建了重組菌株BL21（DE3）（pXKKSL4），且含有K88ac－K99-3ST1-LTB融合基因的pXKKSL4表達(dá)載體能高效表達(dá)，這樣不但解決了ST1腸毒素毒性問題，而且又賦予其免疫原性，同時增加K99菌毛可使免疫效果進(jìn)一步增強，這樣從腸毒素和菌毛兩種途徑達(dá)到預(yù)防由ETEC引起的腹瀉目的，從而有效控制腹瀉的發(fā)生，必將帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1 載體和菌株

大腸桿菌C83539、C83902、HB101（pSLM004） ST+強毒株和DH5α（pEWD299）LT+、LTB+菌株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；受體菌DH5α和BL21（DE3）、質(zhì)粒pET-28a和pGEM－T購自TaKaRa公司。

1.2 試劑

T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自TaKaRa公司；卡那霉素，氨芐青霉素、DNA Purification System、PCR克隆試劑盒購自Promega公司；K88ac、K99、ST1和LTB ELISA檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；健康兔血清和羊抗兔酶標(biāo)二抗購自TaKaRa公司。

1.3 表達(dá)質(zhì)粒pXKKSL4的構(gòu)建

根據(jù)Dykes和許崇波等報道的ST、K88ac、K99和LTB基因序列［8-10］設(shè)計了相應(yīng)引物。為了使ST13端兩個半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸（TGT→AGT）設(shè)計了3對定點突變引物，P1，P2（包含HindIII、NdeI酶切位點）、P3，P4（包含NdeI、EcoRI酶切位點）、P5，P6（包含EcoRI、BamHI酶切位點）。K88ac 擴增所需引物分別為P7、P8（包含BglⅡ、NcoI酶切位點）。K99 擴增所需引物分別為P9、P10（包含NcoI、HindIII酶切位點）。LTB擴增所需引物P11、P12（包含BamHI、NotI酶切位點）。上述引物序列見表1。

利用PCR引物P7、P8和P9、P10分別從大腸桿菌C83902和C83539質(zhì)粒中分別擴增出了330 bp K88ac和393 bp K99基因片段，回收PCR擴增產(chǎn)物，DNA連接酶串聯(lián)后連接至pGEM－T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pXKK2。利用3對PCR引物P1、P2，P3、P4和P5、P6擴增出3個突變的ST1基因，T4DNA連接酶將其串聯(lián)構(gòu)成189bp ST1-ST1-ST1突變基因片段。利用PCR引物P11、P12從大腸桿菌C83902質(zhì)粒中分別擴增出387 bp LTB基因片段并回收PCR擴增產(chǎn)物。將ST1-ST1-ST1串聯(lián)突變基因片段與LTB基因片段用DNA連接酶連接并克隆至pGEM－T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pXSL2。BglⅡ、HindIII和HindIII、NotI分別酶切重組質(zhì)粒pXKK2和pXSL2，回收K88ac－K99和ST1-ST1-ST1-LTB片段，T4DNA連接酶連接串聯(lián)成K88ac－K99-3ST1-LTB片段。PCR反應(yīng)體系：1 μL模板，2 μL 5 mmol·L-1 dNTP，2 μL 0.1 mol·L-1引物，5 μL 10×Buffer，1 μL 3 U·μL-1 Taq DNA聚合酶，39 μL ddH2O。PCR擴增程序為預(yù)變性 95℃ 5min ，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。pET-28a和PCR擴增產(chǎn)物分別用BglⅡ和NotI酶切后加入T4 DNA連接酶16℃過夜，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3） 中，涂布于Kan/LB平板上，篩選出的陽性克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并送至公司進(jìn)行序列測定。

1.4 重組菌株BL21（DE3）（pXKKSL4）表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE分析

取Kan/LB平板，吸取200 μLBL21（DE3）（pXKKSL4）菌液均勻涂布并放置37℃培養(yǎng)16～18h，挑陽性菌落于含Kan抗性的5 mL液體LB培養(yǎng)基中170 r·min-1，37℃培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)菌液以1%比例接種到250 mL含30μg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)，170 r·min-1振搖培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長期（OD600=0.4～0.6）后加入IPTG，其終濃度為1mmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)4h后收集菌體加入20 mL 50 mmol·L-1 Tris·Cl-2 mmol·L-1 EDTA緩沖液進(jìn)行洗滌，12 000 r·min-1離心10 min，加入10 mL 10 mmol·L-1 Tris·CL、2 mL Triton X-100和終濃度1 mg·mL-1的溶菌酶，30 ℃孵育15 min，超聲波破碎2個10 s，12 000 r·min-1離心15 min收集沉淀進(jìn)行SDS－PAGE檢測［11］。

1.5 K88ac－K99-3ST1-LTB融合蛋白的ELISA檢測

吸取BL21（DE3）（pXKKSL4）菌體、陽性對照菌株HB101（pSLM004） ST+、 DH5α（pEWD299）LT+強毒株和陰性對照BL21（DE3）（pET-28a）菌體分別進(jìn)行超聲波破碎，ELISA檢測菌體裂解物。。

1.6 重組菌株BL21（DE3）（pXKKSL4）的毒性測定

重組菌BL21（DE3）（pXKKSL4）培養(yǎng)物離心收集上清并對沉淀進(jìn)行裂解制備包涵體粗提物，按照文獻(xiàn)提供方法分別實施乳鼠灌胃試驗確定融合蛋白是否具有ST1毒性，當(dāng)G/C值≥0.09則融合蛋白具有ST1毒性，如G/C值≤0.083則融合蛋白已失去ST1毒性［12］。

1.7 免疫保護試驗

BL21（DE3）（pXKKSL4）菌液IPTG誘導(dǎo)4 h后，取50 mL菌液12 000 r·min-1離心10 min，棄上清收集菌體，用5 mL TE （50 mmol·L-1 Tris·Cl，2 mmol·L-1 EDTA）重懸菌體，加入5 mL 1%TritonX-100和終濃度100 μg·mL-1的溶菌酶，30 ℃水浴靜置15 min，超聲波裂解菌體2個10 s后離心收集沉淀制備包涵體粗提物，將其進(jìn)行10倍稀釋并加入10%氫氧化鋁膠制備抗原。另外，用終濃度0.4%甲醛對BL21（DE3）（pXKKSL4）菌液（1.24×1010 CFU·mL-1）進(jìn)行滅活，加入10%氫氧化鋁膠混勻，既可作為免疫用抗原。選取300只18～22g小鼠隨機分為6組，每組50只，菌株氫氧化鋁佐劑苗和包涵體粗提物氫氧化鋁佐劑苗分別進(jìn)行腹腔免疫接種，第二次免疫間隔14d后進(jìn)行，二免14 d后進(jìn)行攻毒試驗，兩組攻毒劑量分別為1 MLD和2 MLD C83902強毒株。腹腔免疫接種K88-LTB雙價苗作為對照，每組50只。

1.8 中和試驗

選取6只2～3kg家兔每組2只，每組分別用包涵體粗提物氫氧化鋁佐劑苗進(jìn)行腹腔免疫。第一組免疫20 d后采集血液并分離血清；第二組免疫2次，兩次免疫間隔時間為14 d，第2次免疫后第15 d采集血液制備血清；第三組免疫3次，每次免疫間隔時間為14 d，第3次免疫后第10 d采集血液制備血清，上述血清分別進(jìn)行乳鼠灌胃中和試驗。

取Amp/LB平板劃線接種HB101（pSLM004）ST+工程菌株，37℃培養(yǎng)過夜并挑取陽性菌落接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后按照1%比例接種于200mL LB肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜離心收集上清，用生理鹽水稀釋10倍備用。取10、12、15、17、20 μL制備的ST1腸毒素，分別用生理鹽水稀釋至總體積0.1 mL后測定1個鼠活性單位ST1腸毒素。等比例兔血清和1個鼠活性單位的ST1腸毒素加入生理鹽水至總體積0.1 mL，37℃培養(yǎng)1 h計算G/C值從而對兔血清抗體的中和效果進(jìn)行評價。試驗組分為3組，每組9只，分別注射 ST1+免疫兔血清并計算G/C值，對照組分為兩組，分別注射ST1+生理鹽水和ST1+健康兔血清并計算G/C值。當(dāng)G/C值≥0.09，中和試驗為陰性而ST1為陽性；當(dāng)G/C值≤0.083，中和試驗為陽性而ST1則為陰性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pXKK2的構(gòu)建

提取大腸桿菌C83539和C83902質(zhì)粒，利用PCR技術(shù)分別擴增出393 bp K99和330 bp K88ac基因片段，T4 DNA連接酶連接PCR擴增產(chǎn)物至pGEM－T載體上構(gòu)建了重組質(zhì)粒pXKK2并轉(zhuǎn)化至DH5α受體菌，取Amp/LB平板進(jìn)行涂布培養(yǎng)過夜后挑取陽性菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后利用質(zhì)粒小量提取試劑盒快速提取質(zhì)粒并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。BglⅡ/HindIII雙酶切該質(zhì)粒進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明723 bp K88ac－K99目的基因片段位于位于750 bp與500 bp之間（圖1），經(jīng)DNA序列分析證實，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pXKK2中含有K88ac－K99基因，且基因序列和閱讀框架均正確。

2.2 重組質(zhì)粒pXSL2的構(gòu)建

利用定點突變技術(shù)以C83902質(zhì)粒為模板克隆出3 個突變的ST1基因，酶切連接成ST1-ST1-ST1基因片段并與從大腸桿菌C83902質(zhì)粒中擴增出的LTB基因片段用T4 DNA連接酶克隆至pGEM－T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pXSL2。HindIII/NotI雙酶切該質(zhì)粒經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明576 bp ST1-ST1-ST1-LTB目的基因片段位于位于750 bp與500 bp之間（圖2），重組質(zhì)粒pXSL2經(jīng)測序證實ST1 3′端兩個半胱氨酸已突變?yōu)榻z氨酸（TGT→AGT）

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pXKKSL4的構(gòu)建

用BglⅡ、HindIII和HindIII、NotI分別酶切重組質(zhì)粒并回收K88ac－K99和ST1-ST1-ST1-LTB片段，并用T4DNA連接酶連接串聯(lián)成K88ac－K99-3ST1-LTB片段，將其插入到BglⅡ/NotI酶切處理的pET-28a中相應(yīng)酶切位點上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pXKKSL4（圖3）。BglⅡ/NotI酶切鑒定表明1 299 bp的K88ac－K99-3ST1-LTB融合基因位于1 000～2 000 bp之間，DNA測序證實其基因序列和閱讀框架均正確，從而表明構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pXKKSL4含有K88ac－K99-3ST1-LTB融合基因（圖4）。

2.4 融合蛋白的SDS－PAGE分析和ELISA檢測

重組菌株BL21（DE3）（pXKKSL4）用1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)4 h后獲高效表達(dá)，SDS－PAGE分析表明目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白含量的35.72%（圖5）。ELISA試劑盒檢測表明樣品OD值≥ 臨界值，表明樣品ST1、LTB、K88ac和K99陽性，K88ac－K99-3ST1-LTB融合蛋白能與ST1單抗、LTB、K88ac和K99抗體相結(jié)合。

2.5 BL21（DE3）（pXKKSL4）重組菌株毒性試驗

為驗證BL21（DE3）（pXKKSL4）重組菌株表達(dá)的K88ac－K99-ST1-LTB融合蛋白是否喪失ST1腸毒素活性，重組菌BL21（DE3）（pXKKSL4）擴大培養(yǎng)后離心收集上清，菌體沉淀破碎制備包涵體粗提物，二者分別進(jìn)行乳鼠灌胃試驗并計算G/C值，結(jié)果均為陰性表明所構(gòu)建的重組菌株表達(dá)K88ac－K99-3ST1-LTB融合蛋白已喪失了ST1腸毒素活性。

2.6 免疫攻毒保護試驗

小鼠用菌株氫氧化鋁佐劑苗和包涵體粗提物氫氧化鋁佐劑苗分別進(jìn)行免疫，C83539和C83902攻毒后均能得到很好保護。其中包涵體粗提物氫氧化鋁佐劑苗免疫組，1 MLD和2 MLD攻毒劑量其免疫保護率分別為96%（48/50）和94%（47/50）；菌株氫氧化鋁佐劑苗免疫組，1 MLD和2 MLD攻毒劑量其免疫保護率分別為98%（39/50）和96%（48/50），對照組免疫保護率分別為88%（44/50）和82%（41/50）。

2.7 中和試驗

不同劑量ST1進(jìn)行乳鼠灌胃試驗從而確定1個鼠活性單位，測得G/C值分別為0.077、0.086、0.095、0.112、0.131，從而確定1個鼠活性單位為15 μL。等比例兔血清和1個鼠活性單位的ST1腸毒素各15 μL混勻后加入生理鹽水至總體積0.1 mL，37℃感作1 h進(jìn)行乳鼠灌胃實驗。結(jié)果表明試驗組三組中和實驗均為陽性，G/C值分別為0.072、0.074、0.063，表明K88ac－K99-3ST1-LTB融合蛋白誘發(fā)的血清抗體能中和腸毒素ST1毒性，對照組中和實驗均為陰性，G/C值分別為0.097、0.108，上述結(jié)果證明K88ac－K99-3ST1-LTB融合蛋白具有很好的免疫原性且產(chǎn)生的抗體能中和ST1毒性。

3 討論

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是導(dǎo)致家畜腹瀉最常見的因素，ETEC能分泌腸毒素和粘著素兩種致病因子，粘著素主要包括K88、K99、987p、F41和F42等［13-16］，ETEC通過粘著素寄居于宿主腸道粘膜的上皮細(xì)胞并大量繁殖，產(chǎn)生大量腸毒素導(dǎo)致其發(fā)生病理性變化引起腹瀉。其中最主要粘著素K88ac是引起腹瀉的間接因子。腸毒素引起致腹瀉的直接因子，包括耐熱性腸毒素ST和不耐熱腸毒素LT，其中ST又分為ST1和ST2兩種，ST1腸毒素含有6個半胱氨酸殘基可形成3對鏈內(nèi)二硫鍵，3對二硫鍵對ST1生物毒性至關(guān)重要，通過定點突變破壞其二硫鍵從而使ST1失去生物毒性。另外ST不具有免疫原性，但與其他大分子偶聯(lián)可使其具有免疫原性。LT由A亞單位和B亞單位組成，全LT或單獨B亞單位都具有良好的免疫原性［17-18］，所以取得高效的免疫預(yù)防效果關(guān)鍵是解決ST毒性和免疫原性。

對于由ETEC引起的腹瀉，目前主要采取藥物進(jìn)行治療或者運用全細(xì)胞苗及特定菌毛苗進(jìn)行免疫接種從而預(yù)防腹瀉，但其治療和預(yù)防效果并不理想，主要是由于當(dāng)前的疫苗廣譜性差及病原菌血清型復(fù)雜多樣等原因造成的。當(dāng)前采用的主要預(yù)防措施是接種K88-K99、K88ac－LTB雙價基因工程苗［19-20］，但這些疫苗都沒解決最主要的致病因子腸毒素ST1免疫原性和毒性問題，導(dǎo)致其并不能使機體產(chǎn)生很好的預(yù)防效果，為此課題組利用基因定點突變技術(shù)，分別擴增出突變的ST1基因、K88ac、K99、和LTB基因，并構(gòu)建了BL21（DE3）（pXKKSL4）重組菌株，且其pXKKSL4表達(dá)載體含有K88ac－K99-3ST1-LTB融合基因，同時融合蛋白在受體菌高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白含量的35.72%。ELISA檢測證實融合蛋白能與ST1單抗、LTB、K88ac和K99抗體相結(jié)合。乳鼠灌胃試驗證實K88ac－K99-3ST1-LTB融合蛋白已喪失了ST1腸毒素活性。免疫保護試驗表明菌株氫氧化鋁佐劑苗和包涵體粗提物氫氧化鋁佐劑苗均具有良好的免疫效果，1 MLD攻毒劑量菌株氫氧化鋁佐劑苗免疫組其免疫保護率分別為98%，1 MLD攻毒劑量包涵體粗提物氫氧化鋁佐劑苗免疫組其免疫保護率為96%，而K88-LTB雙價苗對照組其免疫保護率為88%，可見構(gòu)建的K88ac－K99-3ST1-LTB疫苗具有很好的免疫效果。上述研究表明課題組成功構(gòu)建了針對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的4種主要毒力因子即腸毒素ST1、LTB、K88ac和K99的四價基因工程滅活疫苗候選菌株，不但解決了ST1腸毒素毒性問題，而且又賦予其免疫原性，同時增加K99菌毛可使免疫效果進(jìn)一步增強，這樣從腸毒素和菌毛兩種途徑，達(dá)到預(yù)防由ETEC引起的腹瀉目的，從而有效控制腹瀉的發(fā)生，為將來制備產(chǎn)腸毒素大腸桿菌基因工程滅活疫苗打下堅實基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：2022-10-22

基金項目：重慶市教育委員會科學(xué)技術(shù)研究項目（KJZD－K202202803）

作者簡介：許崇利（1974—），男，博士，從事微生物分子生物學(xué)研究。

*通信作者：許崇波（1968—），男，教授，從事微生物分子生物學(xué)研究，e－mail：xcb921@163.com。