王同玲　劉丹丹　李海燕　張麗媛　楊瑞瑞　陸恒　王浩　丁玉松

摘要：目的 探討葡萄籽原花青素（GSPE）對(duì)高脂高糖誘導(dǎo)小鼠胰島素瘤MIN6細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；Lillie染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子（Fe2+）；檢測(cè)谷胱甘肽（GSH），丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量；熒光探針DCFH－DA標(biāo)記檢測(cè)活性氧簇（ROS）水平；Western blot檢測(cè)鐵死亡關(guān)鍵蛋白（GPX4和ACSL4）和Xc-/GPX4信號(hào)通路蛋白（SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM）的表達(dá)。結(jié)果 高脂高糖處理抑制了MIN6細(xì)胞活力，使得Fe2+，MDA含量，ROS水平增加，GSH，SOD含量降低，ACSL4表達(dá)水平升高，GPX4以及通路蛋白SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM表達(dá)水平降低。施加不同濃度的GSPE或鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）干預(yù)后，MIN6細(xì)胞活力增加，F(xiàn)e2+，MDA含量，ROS水平，ACSL4表達(dá)水平均顯著降低，GSH，SOD含量明顯升高（P<0.05）。GPX4以及通路蛋白SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 GSPE能夠通過(guò)上調(diào)Xc-/GPX4信號(hào)通路拮抗MIN6細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

關(guān)鍵詞：高糖高脂；MIN6；鐵死亡；Xc-/GPX4

中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)R285文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

Grape seed proanthocyanidins exacts antagonize high－glucose and high－fat－induced

ferroptosis in MIN6 cells via the Xc-/GPX4 pathway

WANG? Tongling1，LIU? Dandan2，LI? Haiyan1，ZHANG? Liyuan1，YANG? Ruirui1，LU? Heng1，WANG? Hao1，DING? Yusong1*

（1 Department of Preventive Medicine， School of Medicine， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 Department

of Preventive Medicine， Xinjiang Second Medical College，Karamay，Xinjiang 834000， China）

Abstract： Objective To investigate the protective effect and possible mechanism of grape seed proanthocyanidins （GSPE） on high－fat and high－sugar induced cell injury in mouse insulinoma MIN6 cells. Methods The cell viability was detected by CCK-8 method; intracellular ferrous ions （Fe2+） were detected by Lillie staining; glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） contents were detected; reactive oxygen species （ROS） levels were detected by fluorescent probe DCFH－DA labeling; western blot was used to detect iron death key proteins （GPX4 and ACSL4） and Xc-/GPX4 signalling pathway proteins （SLC7A11， SLC3A2， GSS and GCLM） by western blot. Results High－fat and high－sugar treatment inhibited MIN6 cell viability， resulting in increased Fe2+， MDA content， ROS levels， decreased GSH， SOD content， increased ACSL4 expression levels and decreased GPX4 and pathway proteins SLC7A11， SLC3A2， GSS and GCLM expression levels. After the administration of different concentrations of GSPE or the ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 （Fer-1）， MIN6 cell viability increased， Fe2+， MDA levels， ROS levels， ACSL4 expression levels were significantly reduced， and GSH and SOD levels were significantly increased （P<0.05）. GPX4 and pathway proteins SLC7A11， SLC3A2， GSS and GCLM expression levels were significantly increased. SLC3A2， GSS and GCLM expression levels were significantly increased （P<0.05）. Conclusion GSPE can antagonize ferroptosis in MIN6 cells through upregulation of the Xc-/GPX4 signaling pathway.

Key words： high glucose and high fat;MIN6;ferroptosis;Xc-/GPX4

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）已經(jīng)成為一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］，DM患者長(zhǎng)期處在糖脂代謝紊亂狀態(tài)，而長(zhǎng)期暴露于高水平的葡萄糖和游離脂肪酸會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙，從而加速DM的發(fā)生發(fā)展［2］。然而胰島β細(xì)胞死亡的機(jī)制尚不明確。流行病學(xué)研究報(bào)告指出過(guò)量的鐵儲(chǔ)存與DM發(fā)展顯著關(guān)聯(lián)。鐵對(duì)胰島β細(xì)胞的毒性，可能是由于Fe2+使線粒體膜電位去極化，導(dǎo)致電子傳遞鏈破壞，產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致胰島素合成和分泌減少［3］，最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙。而過(guò)量的鐵離子會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一種獨(dú)特的鐵依賴性的細(xì)胞死亡方式——鐵死亡［4］。

鐵死亡最重要的特征是亞鐵離子（Fe2+）濃度增加以及通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)量ROS導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，Xcˉ/GPX4是一種重要的抗氧化系統(tǒng)，也是鐵死亡主要的發(fā)生途徑之一，Xcˉ系統(tǒng)是由機(jī)體細(xì)胞膜上輕鏈亞基（Solute Carrier Family 7，Member 11，SLC7A11）和重鏈亞基（Solute Carrier Family 3，Member 2，SLC3A2）兩個(gè)亞基組成［5］，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）利用GSH將脂質(zhì)過(guò)氧化物還原，GSH主要由谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，modifier subunit，GCLM）和谷胱甘肽合成酶（Glutathionesynthetase，GSS）催化，當(dāng)Xcˉ系統(tǒng)被抑制時(shí)，GSH合成降低，導(dǎo)致GPX4不能利用GSH，進(jìn)而引發(fā)鐵死亡。

目前幾乎沒(méi)有文獻(xiàn)關(guān)注DM發(fā)病機(jī)制和胰島β細(xì)胞鐵死亡之間的聯(lián)系。而多酚作為植物來(lái)源的生物活性化合物，已被用于治療由鐵過(guò)載引起的細(xì)胞功能障礙［6］。原花青素作為一種多酚類化合物，可抵抗自由基和氧化應(yīng)激，是一種強(qiáng)有力的鐵螯合劑和抗氧化劑，可以通過(guò)抑制受損部位微環(huán)境下的鐵死亡促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)［7］。然而到目前為止，原花青素對(duì)胰島β細(xì)胞的潛在抗糖尿病作用機(jī)制尚未被探索。因此本研究以MIN6為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用高濃度葡萄糖聯(lián)合高濃度棕櫚酸鈉（high Glucose and high Sodium Palmitate，GP）模擬2型糖尿病的病理特征，建立胰島β細(xì)胞體外損傷模型，以鐵死亡為切入點(diǎn)，探討葡萄籽原花青素（Grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE）對(duì)高糖、高脂誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞死亡的抑制作用，旨在為DM的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要藥物和試劑

小鼠胰島瘤細(xì)胞（MIN6細(xì)胞）購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司，胎牛血清和1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司，CCK8試劑盒購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司，GSH、MDA、SOD試劑盒、DCFH－DA 探針和Lillie染色檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress公司，GPX4，酰基輔酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acyl－CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4），SLC7A11和GCLM單克隆抗體購(gòu)自Abcam，SLC3A2）克隆抗體和GSS單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。鼠抗β-actin購(gòu)自武漢博士得生物工程有限公司。羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。高葡萄糖（high Glucose，HG）和棕櫚酸鈉（Sodium Palmitate，SP）購(gòu)自西安鯤創(chuàng)科技有限公司，葡萄籽原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（GSPE）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將胰島MIN6細(xì)胞培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基（每50mL的完全培養(yǎng)基含有10mL胎牛血清；500μL青霉素－鏈霉素和50μL巰基乙醇）。將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中24h后觀察細(xì)胞數(shù)量與形態(tài)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MIN6胰島細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)7×105個(gè)24h后，設(shè)為6組：1）Control：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)；2）GP：HG 25mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1；3）L－GSPE：HG 25 mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1+GSPE 10mg·L-1；4）M－GSPE：HG 25mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1+GSPE 20mg·L-1；5）H－GSPE組：HG 25mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1+GSPE 30 mg·L-1；6）Fer-1：HG 25mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1+Fer-1 1 μmol·L-1。

1.4 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MIN6胰島細(xì)胞按7×103個(gè)·孔-1細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，各組施加不同的實(shí)驗(yàn)處理后，棄上清，每孔加90μL的完全培養(yǎng)基和10μL的CCK8溶液，再次在培養(yǎng)箱中孵育1.5h后，于酶標(biāo)儀495nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.5 GSH，MDA，SOD的檢測(cè)

GSH含量測(cè)定采用微量酶標(biāo)法，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，SOD活力測(cè)定采用WST-1法。具體操作見試劑盒說(shuō)明書。

1.6 ROS水平測(cè)定

采用DCFH－DA （10 μmol·L-1）法測(cè)定細(xì)胞 ROS 水平。將MIN6細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中。處理后的細(xì)胞與分子探針（1μmol·L-1）在37℃下孵育30min，然后用PBS沖洗3次。使用熒光顯微鏡收集細(xì)胞的所有熒光圖像（×400），用ImageJ用于分析所有的圖像。

1.7 細(xì)胞中Fe2+ 含量測(cè)定

使用Lillie染色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞二價(jià)鐵，根據(jù)制造商的說(shuō)明，將處理后的細(xì)胞在染色溶液A中37℃孵育30min，然后用核染色溶液B染色2min，最后使用PBS沖洗3遍。使用熒光顯微鏡收集各組細(xì)胞的熒光圖像（×400），用ImageJ分析所有的圖像。

1.8 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)

將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱（37℃、5 % CO2）中培養(yǎng)24h；待細(xì)胞貼壁后施加不同處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并收集圖像（×200）。

1.9 碘化丙啶（PI）染色

將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)的密度接種于6孔板中，在37℃的PI染色液培養(yǎng)箱中孵育20～30 min，然后用PBS沖洗3次。最后使用熒光顯微鏡收集所有細(xì)胞的熒光圖像（×200）。

1.10 Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白

將六孔板中加入預(yù)冷的PBS洗滌1次，然后每孔加入130μL的RIPA裂解液，在冰上裂解30 min后，收集細(xì)胞，離心25 min（4℃、12000g）收集上清，使用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量，進(jìn)行蛋白濃度的配平，然后加入總體積1/4的5×上樣緩沖液，置于100℃金屬浴煮10 min。每孔加入等量總蛋白樣品使用SDS－PAGE分離樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉常溫下封閉2h，TBST漂洗3次。分別使用稀釋過(guò)的Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次。加入相應(yīng)的Ⅱ抗室溫孵育2h。TBST洗滌3次，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)所有蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用X-±S表示。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0。采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用P<0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖高脂造成的MIN6細(xì)胞損傷中存在鐵死亡

由圖1可知，GP即高糖高脂組（HG 25 mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1）作用于MIN6胰島β細(xì)胞24h，細(xì)胞活力為55.74%，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）而鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin在GP的基礎(chǔ)上作用于MIN6胰島β細(xì)胞24h，細(xì)胞活力下降為33.08%，相比對(duì)照組細(xì)胞活力明顯下降（P<0.05）。表明erastin誘導(dǎo)MIN6胰島β細(xì)胞發(fā)生了鐵死亡，進(jìn)一步加劇了高糖高脂對(duì)細(xì)胞的損傷。在GP處理的基礎(chǔ)上，再給予MIN6胰島β細(xì)胞鐵死亡抑制劑Fer-1，自噬抑制劑CQ，壞死抑制劑Necrostatin-1，和凋亡抑制劑Z－VAD－FMK處理24h后，細(xì)胞活力分別上升71.39%，59.71%，59.45%和55.73%。而鐵死亡抑制劑Fer-1對(duì)細(xì)胞活力的改善效果優(yōu)于其他抑制劑組，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明鐵死亡在高糖高脂造成的MIN6胰島β細(xì)胞的功能損傷中扮演著至關(guān)重要的作用。

2.2 Fer-1對(duì)高糖、高脂誘導(dǎo)的MIN6胰島β細(xì)胞中氧化指標(biāo)MDA，SOD，GSH的影響

經(jīng) GP處理24h后，與對(duì)照組相比，MIN6細(xì)胞內(nèi) GSH 含量和 SOD 活力顯著降低（P<0. 05）；MDA含量顯著上升（P<0. 05），加入 Fer-1 處理后，與GP相比，細(xì)胞內(nèi) GSH 含量和 SOD 活力顯著升高，同時(shí)MDA含量明顯降低（P<0. 05），見圖2。

2.3 Fer-1對(duì)高糖、高脂誘導(dǎo)的MIN6胰島β細(xì)胞中Fe2+的影響

Fer-1對(duì)高糖、高脂誘導(dǎo)的MIN6胰島β細(xì)胞中Fe2+的影響結(jié)果見圖3。

用Lillie試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量，由圖3可知，經(jīng) GP處理24h后，與對(duì)照組相比，GP組MIN6 細(xì)胞內(nèi) Fe2+水平明顯升高（P<0. 05）；加入 Fer-1處理后得到改善，與GP相比，細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平明顯降低（P<0. 05）。

2.4 Fer-1對(duì)高糖、高脂誘導(dǎo)的MIN6胰島β細(xì)胞中ROS水平的影響

DCFH－DA熒光探針檢測(cè)MIN6細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化，圖4 可知熒光顯微鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)GP處理24h后，GP組熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)，表明GP組 ROS的含量明顯高于正常組（P<0. 05）；經(jīng)過(guò) Fer-1處理，與GP相比，熒光強(qiáng)度明顯降低（P<0. 05），表明ROS的積累水平明顯降低。

2.5 GSPE通過(guò)抑制鐵死亡保護(hù)高糖高脂誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞功能損傷

為了觀察GSPE對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度的GSPE對(duì)高糖高脂造成的細(xì)胞活力的影響。

圖5結(jié)果表明，不同濃度GSPE處理后，MIN6細(xì)胞死亡數(shù)量顯著降低，細(xì)胞活力得到明顯改善（P<0. 05）。改善效果呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，高劑量GSPE改善效果優(yōu)于Fer-1處理組（P<0. 05）。接下來(lái)，評(píng)估了MIN6細(xì)胞所表現(xiàn)出的形態(tài)學(xué)變化，在正常條件下培養(yǎng)的MIN6細(xì)胞呈多邊形，與其他細(xì)胞緊密相連。經(jīng)高糖、高脂處理后，細(xì)胞形狀更不規(guī)則，尖端突出，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞附著松散，呈圓形，與鐵死亡的形態(tài)學(xué)特征相似。GSPE和Fer-1處理效果相同；死亡細(xì)胞粘附減少，貼壁細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)（圖6）。由圖6 PI染色結(jié)果可知，對(duì)照組發(fā)生死亡的細(xì)胞數(shù)量明顯低于GP處理組。

2.6 GSPE和Fer-1對(duì)高糖、高脂誘導(dǎo)的MIN6胰島β細(xì)胞中鐵死亡關(guān)鍵蛋白ACSL4和GPX4蛋白表達(dá)的影響

由圖7可知，在長(zhǎng)期暴露于高糖、高脂的MIN6胰島細(xì)胞中鐵死亡關(guān)鍵蛋白ACSL4表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05），GPX4表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05），而GSPE干預(yù)后顯著改善了這兩個(gè)關(guān)鍵性蛋白的表達(dá)水平（P<0.05），改善程度近似與Fer-1組。結(jié)果表明GSPE可能通過(guò)抑制細(xì)胞發(fā)生鐵死亡來(lái)改善MIN6胰島細(xì)胞功能。

2.7 GSPE通過(guò)激活Xc-/GPX4信號(hào)通路來(lái)保護(hù)高糖高脂誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞鐵死亡

Xc-/GPX4信號(hào)通路在鐵死亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。為了確定GSPE對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的鐵死亡是否通過(guò)激活Xc-/GPX4通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，本次實(shí)驗(yàn)評(píng)估了SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM在MIN6細(xì)胞的表達(dá)。如圖8所示，與對(duì)照組相比，GP組MIN6細(xì)胞中的SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM水平均低于對(duì)照組。這些結(jié)果表明，Xc-/GPX4通路可能參與了高糖高脂誘導(dǎo)的鐵死亡。施加不同劑量的GSPE處理提高了SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM的表達(dá)水平，改善效果近似與Fer-1處理組。表明GSPE對(duì)MIN6細(xì)胞的保護(hù)作用至少部分是通過(guò)激活Xc-/GPX4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

3 討論

DM是目前面臨的最嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題之一，是一種以血糖水平升高為特征的進(jìn)行性代謝綜合征，目前認(rèn)為DM的發(fā)病機(jī)制主要是胰島β細(xì)胞功能受損，而由DM誘發(fā)的糖脂代謝紊亂又是胰島β細(xì)胞功能受損的主要誘因［8］。目前研究認(rèn)為鐵死亡主要涉及到兩個(gè)方面。一是谷胱甘肽（GSH） 的消耗，二是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4） 的活性降低［9］。GPX4 能夠降解脂質(zhì)過(guò)氧化物，在鐵死亡發(fā)生過(guò)程中對(duì)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷起到關(guān)鍵作用。由于GSH是GPX4酶分解過(guò)氧化物過(guò)程中至關(guān)重要的輔助因子，降低GSH的含量，會(huì)導(dǎo)致GPX4的酶活性顯著降低，使得細(xì)胞清除脂質(zhì)過(guò)氧化物的能力下降。最終引起細(xì)胞膜氧化損傷，使得膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［10］。迄今為止，只有少數(shù)研究探索了DM和鐵死亡之間的聯(lián)系，而沒(méi)有關(guān)于鐵死亡在高糖高脂誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞功能損傷中的作用的報(bào)道。目前的研究表明鐵死亡與糖脂毒性誘導(dǎo)的胰腺損傷中β細(xì)胞死亡有關(guān)。植物性食物在降血糖和DM防治中發(fā)揮著重要作用。植物性食物中的多酚類物質(zhì)作為植物性化合物可能通過(guò)充當(dāng)鐵螯合劑減少GSH消耗，GPX4失活和脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)而抑制了MIN6細(xì)胞中的鐵蓄積和鐵死亡［11］。GSPE作為一種多酚類化合物，其抗氧化能力與其鐵螯合功能密切相關(guān)［6］，通過(guò)減輕細(xì)胞鐵死亡從而促進(jìn)細(xì)胞功能的改善。此外，GSPE逆轉(zhuǎn)了鐵死亡的關(guān)鍵指標(biāo)：GPX4和ACSL4的表達(dá)變化，并增加了Xc-/GPX4通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，GSPE激活Xc-/GPX4信號(hào)通路，拮抗糖脂毒性誘導(dǎo)的氧化損傷，抑制β細(xì)胞的鐵死亡。

GPX4是預(yù)防鐵死亡的主要酶。有證據(jù)表明，產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞易受鐵死亡的影響，除非它們受到GPX4的保護(hù)［12］。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，過(guò)量的鐵也是引發(fā)鐵死亡的關(guān)鍵因素［4］。而鐵超載是DM的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素［13］；ACSL4是參與代謝相關(guān)疾病的關(guān)鍵因素［14］。研究表明［15］ACSL4和GPX4被認(rèn)為是調(diào)節(jié)鐵死亡的主要成分。ACSL4被認(rèn)為是鐵死亡的重要調(diào)控因子，而ACSL4的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了鐵死亡的發(fā)生發(fā)展［16］。因此，本研究選用高糖高脂刺激小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞，建立細(xì)胞受損的體外模型。探究鐵死亡在其中扮演的作用以及GSPE對(duì)MIN6細(xì)胞活性的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖高脂會(huì)造成細(xì)胞活性下降。鐵死亡是由于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平明顯升高，而引發(fā)細(xì)胞發(fā)生的一種不同于其他類型的細(xì)胞死亡形式［17］。MDA作為反映機(jī)體脂質(zhì)氧化損傷程度的敏感性重要指標(biāo)，而SOD是抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分之一，能直觀反應(yīng)細(xì)胞抗氧化能力和過(guò)氧化水平［18］。GSH在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，減少氧化應(yīng)激，減輕鐵死亡中發(fā)揮著不可或缺的作用［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖高脂造成MDA含量明顯升高，SOD活力和GSH含量明顯降低，在加入Fer-1后，MDA、GSH和SOD活力發(fā)生顯著改善，基本恢復(fù)正常水平。結(jié)果說(shuō)明鐵死亡抑制劑Fer-1對(duì)高糖高脂造成的細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。由過(guò)量的Fe2+介導(dǎo)芬頓反應(yīng)會(huì)引起ROS積累，進(jìn)而加速鐵死亡的進(jìn)程。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Fe2+和ROS水平也進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示高糖高脂不僅會(huì)引起鐵死亡關(guān)鍵蛋白的變化，也會(huì)導(dǎo)致Fe2+和ROS水平升高。

Xc-/GPX4通路上的Xc-系統(tǒng)是細(xì)胞膜上控制胱氨酸和谷氨酸進(jìn)出的主要通道，包括輕鏈亞基（xCT，SLC7A11）和重鏈亞基（CD98hc，SLC3A2）兩個(gè)亞基組，其中SLC7A11在GSH的合成尤為重要，當(dāng)SLC7A11的表達(dá)受到抑制時(shí)，會(huì)顯著減少細(xì)胞對(duì)胱氨酸的攝取，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)紊亂，進(jìn)一步增加細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。在鐵死亡中也可以通過(guò)調(diào)控Xc-/GPX4通路中關(guān)鍵物質(zhì) GSS、GCLM等來(lái)調(diào)控下游GSH的含量進(jìn)而抑制ROS水平從而減緩鐵死亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)用Western blot結(jié)果驗(yàn)證Xc-/GPX4通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示高糖高脂組的蛋白表達(dá)水平有下降趨勢(shì)，在施加GSPE干預(yù)后，蛋白表達(dá)水平明顯上升，且高濃度GSPE作用效果與Fer-1組相似。

綜上所述，GSPE作為一種鐵螯合劑和抗氧化劑，改善細(xì)胞活性可能是通過(guò)抑制細(xì)胞發(fā)生鐵死亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。其機(jī)制可能是GSPE通過(guò)激活Xc-/GPX4信號(hào)通路來(lái)抑制鐵死亡，從而減少DM中β細(xì)胞損傷和功能障礙。本研究為DM的防治以及植物化學(xué)物在DM中發(fā)揮的作用提供了一定的參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-01-11

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2017M613310XB）；石河子大學(xué)科研項(xiàng)目（ZZZC201704A）

作者簡(jiǎn)介：王同玲（1994—），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物對(duì)糖尿病的影響及其機(jī)制。

*通信作者：丁玉松（1979—），男，副教授，從事天然產(chǎn)物對(duì)糖尿病的影響及其機(jī)制，e－mail： 51603030@qq.com。