王同玲　劉丹丹　李海燕　張麗媛　楊瑞瑞　陸恒　王浩　丁玉松

摘要：目的 探討葡萄籽原花青素（GSPE）對高脂高糖誘導小鼠胰島素瘤MIN6細胞損傷的保護作用及可能機制。方法 采用CCK-8法檢測細胞活力；Lillie染色檢測細胞內(nèi)亞鐵離子（Fe2+）；檢測谷胱甘肽（GSH），丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量；熒光探針DCFH－DA標記檢測活性氧簇（ROS）水平；Western blot檢測鐵死亡關鍵蛋白（GPX4和ACSL4）和Xc-/GPX4信號通路蛋白（SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM）的表達。結(jié)果 高脂高糖處理抑制了MIN6細胞活力，使得Fe2+，MDA含量，ROS水平增加，GSH，SOD含量降低，ACSL4表達水平升高，GPX4以及通路蛋白SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM表達水平降低。施加不同濃度的GSPE或鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）干預后，MIN6細胞活力增加，F(xiàn)e2+，MDA含量，ROS水平，ACSL4表達水平均顯著降低，GSH，SOD含量明顯升高（P<0.05）。GPX4以及通路蛋白SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM表達水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 GSPE能夠通過上調(diào)Xc-/GPX4信號通路拮抗MIN6細胞發(fā)生鐵死亡。

關鍵詞：高糖高脂；MIN6；鐵死亡；Xc-/GPX4

中圖分類號：中圖分類號R285文獻標志碼：A文獻標識碼

Grape seed proanthocyanidins exacts antagonize high－glucose and high－fat－induced

ferroptosis in MIN6 cells via the Xc-/GPX4 pathway

WANG? Tongling1，LIU? Dandan2，LI? Haiyan1，ZHANG? Liyuan1，YANG? Ruirui1，LU? Heng1，WANG? Hao1，DING? Yusong1*

（1 Department of Preventive Medicine， School of Medicine， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 Department

of Preventive Medicine， Xinjiang Second Medical College，Karamay，Xinjiang 834000， China）

Abstract： Objective To investigate the protective effect and possible mechanism of grape seed proanthocyanidins （GSPE） on high－fat and high－sugar induced cell injury in mouse insulinoma MIN6 cells. Methods The cell viability was detected by CCK-8 method; intracellular ferrous ions （Fe2+） were detected by Lillie staining; glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） contents were detected; reactive oxygen species （ROS） levels were detected by fluorescent probe DCFH－DA labeling; western blot was used to detect iron death key proteins （GPX4 and ACSL4） and Xc-/GPX4 signalling pathway proteins （SLC7A11， SLC3A2， GSS and GCLM） by western blot. Results High－fat and high－sugar treatment inhibited MIN6 cell viability， resulting in increased Fe2+， MDA content， ROS levels， decreased GSH， SOD content， increased ACSL4 expression levels and decreased GPX4 and pathway proteins SLC7A11， SLC3A2， GSS and GCLM expression levels. After the administration of different concentrations of GSPE or the ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 （Fer-1）， MIN6 cell viability increased， Fe2+， MDA levels， ROS levels， ACSL4 expression levels were significantly reduced， and GSH and SOD levels were significantly increased （P<0.05）. GPX4 and pathway proteins SLC7A11， SLC3A2， GSS and GCLM expression levels were significantly increased. SLC3A2， GSS and GCLM expression levels were significantly increased （P<0.05）. Conclusion GSPE can antagonize ferroptosis in MIN6 cells through upregulation of the Xc-/GPX4 signaling pathway.

Key words： high glucose and high fat;MIN6;ferroptosis;Xc-/GPX4

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）已經(jīng)成為一個世界性的公共衛(wèi)生問題［1］，DM患者長期處在糖脂代謝紊亂狀態(tài)，而長期暴露于高水平的葡萄糖和游離脂肪酸會導致β細胞功能障礙，從而加速DM的發(fā)生發(fā)展［2］。然而胰島β細胞死亡的機制尚不明確。流行病學研究報告指出過量的鐵儲存與DM發(fā)展顯著關聯(lián)。鐵對胰島β細胞的毒性，可能是由于Fe2+使線粒體膜電位去極化，導致電子傳遞鏈破壞，產(chǎn)生ROS，導致胰島素合成和分泌減少［3］，最終導致胰島β細胞功能障礙。而過量的鐵離子會導致細胞發(fā)生一種獨特的鐵依賴性的細胞死亡方式——鐵死亡［4］。

鐵死亡最重要的特征是亞鐵離子（Fe2+）濃度增加以及通過芬頓反應產(chǎn)生過量ROS導致細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，Xcˉ/GPX4是一種重要的抗氧化系統(tǒng)，也是鐵死亡主要的發(fā)生途徑之一，Xcˉ系統(tǒng)是由機體細胞膜上輕鏈亞基（Solute Carrier Family 7，Member 11，SLC7A11）和重鏈亞基（Solute Carrier Family 3，Member 2，SLC3A2）兩個亞基組成［5］，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）利用GSH將脂質(zhì)過氧化物還原，GSH主要由谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，modifier subunit，GCLM）和谷胱甘肽合成酶（Glutathionesynthetase，GSS）催化，當Xcˉ系統(tǒng)被抑制時，GSH合成降低，導致GPX4不能利用GSH，進而引發(fā)鐵死亡。

目前幾乎沒有文獻關注DM發(fā)病機制和胰島β細胞鐵死亡之間的聯(lián)系。而多酚作為植物來源的生物活性化合物，已被用于治療由鐵過載引起的細胞功能障礙［6］。原花青素作為一種多酚類化合物，可抵抗自由基和氧化應激，是一種強有力的鐵螯合劑和抗氧化劑，可以通過抑制受損部位微環(huán)境下的鐵死亡促進細胞修復［7］。然而到目前為止，原花青素對胰島β細胞的潛在抗糖尿病作用機制尚未被探索。因此本研究以MIN6為實驗對象，利用高濃度葡萄糖聯(lián)合高濃度棕櫚酸鈉（high Glucose and high Sodium Palmitate，GP）模擬2型糖尿病的病理特征，建立胰島β細胞體外損傷模型，以鐵死亡為切入點，探討葡萄籽原花青素（Grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE）對高糖、高脂誘導胰島β細胞死亡的抑制作用，旨在為DM的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要藥物和試劑

小鼠胰島瘤細胞（MIN6細胞）購自上海富衡生物科技有限公司，胎牛血清和1640培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司，CCK8試劑盒購自北京博奧拓達科技有限公司，GSH、MDA、SOD試劑盒、DCFH－DA 探針和Lillie染色檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）購自美國MedChemexpress公司，GPX4，?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl－CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4），SLC7A11和GCLM單克隆抗體購自Abcam，SLC3A2）克隆抗體和GSS單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。鼠抗β-actin購自武漢博士得生物工程有限公司。羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。高葡萄糖（high Glucose，HG）和棕櫚酸鈉（Sodium Palmitate，SP）購自西安鯤創(chuàng)科技有限公司，葡萄籽原花青素標準品（GSPE）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將胰島MIN6細胞培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基（每50mL的完全培養(yǎng)基含有10mL胎牛血清；500μL青霉素－鏈霉素和50μL巰基乙醇）。將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中24h后觀察細胞數(shù)量與形態(tài)。選取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組

將對數(shù)生長期的MIN6胰島細胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)7×105個24h后，設為6組：1）Control：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)；2）GP：HG 25mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1；3）L－GSPE：HG 25 mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1+GSPE 10mg·L-1；4）M－GSPE：HG 25mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1+GSPE 20mg·L-1；5）H－GSPE組：HG 25mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1+GSPE 30 mg·L-1；6）Fer-1：HG 25mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1+Fer-1 1 μmol·L-1。

1.4 CCK8法檢測細胞活力

將對數(shù)生長期的MIN6胰島細胞按7×103個·孔-1細胞接種于96孔板中，每組設置5個復孔，培養(yǎng)24h后，各組施加不同的實驗處理后，棄上清，每孔加90μL的完全培養(yǎng)基和10μL的CCK8溶液，再次在培養(yǎng)箱中孵育1.5h后，于酶標儀495nm波長處測定吸光度，計算細胞活力。

1.5 GSH，MDA，SOD的檢測

GSH含量測定采用微量酶標法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，SOD活力測定采用WST-1法。具體操作見試劑盒說明書。

1.6 ROS水平測定

采用DCFH－DA （10 μmol·L-1）法測定細胞 ROS 水平。將MIN6細胞以每孔1×105個細胞的密度接種于6孔板中。處理后的細胞與分子探針（1μmol·L-1）在37℃下孵育30min，然后用PBS沖洗3次。使用熒光顯微鏡收集細胞的所有熒光圖像（×400），用ImageJ用于分析所有的圖像。

1.7 細胞中Fe2+ 含量測定

使用Lillie染色檢測試劑盒檢測細胞二價鐵，根據(jù)制造商的說明，將處理后的細胞在染色溶液A中37℃孵育30min，然后用核染色溶液B染色2min，最后使用PBS沖洗3遍。使用熒光顯微鏡收集各組細胞的熒光圖像（×400），用ImageJ分析所有的圖像。

1.8 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學

將細胞以每孔1×105個細胞的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱（37℃、5 % CO2）中培養(yǎng)24h；待細胞貼壁后施加不同處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的變化并收集圖像（×200）。

1.9 碘化丙啶（PI）染色

將細胞以每孔1×105個的密度接種于6孔板中，在37℃的PI染色液培養(yǎng)箱中孵育20～30 min，然后用PBS沖洗3次。最后使用熒光顯微鏡收集所有細胞的熒光圖像（×200）。

1.10 Western blotting 實驗檢測鐵死亡相關蛋白

將六孔板中加入預冷的PBS洗滌1次，然后每孔加入130μL的RIPA裂解液，在冰上裂解30 min后，收集細胞，離心25 min（4℃、12000g）收集上清，使用BCA試劑盒測定總蛋白含量，進行蛋白濃度的配平，然后加入總體積1/4的5×上樣緩沖液，置于100℃金屬浴煮10 min。每孔加入等量總蛋白樣品使用SDS－PAGE分離樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉常溫下封閉2h，TBST漂洗3次。分別使用稀釋過的Ⅰ抗4℃孵育過夜。TBST洗滌3次。加入相應的Ⅱ抗室溫孵育2h。TBST洗滌3次，最后使用ECL化學發(fā)光法檢測所有蛋白的相對表達量。

1.11 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用X-±S表示。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS20.0。采用單因素方差分析或t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均采用P<0.05，認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖高脂造成的MIN6細胞損傷中存在鐵死亡

由圖1可知，GP即高糖高脂組（HG 25 mmol·L-1+SP 200 μmol·L-1）作用于MIN6胰島β細胞24h，細胞活力為55.74%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）而鐵死亡誘導劑erastin在GP的基礎上作用于MIN6胰島β細胞24h，細胞活力下降為33.08%，相比對照組細胞活力明顯下降（P<0.05）。表明erastin誘導MIN6胰島β細胞發(fā)生了鐵死亡，進一步加劇了高糖高脂對細胞的損傷。在GP處理的基礎上，再給予MIN6胰島β細胞鐵死亡抑制劑Fer-1，自噬抑制劑CQ，壞死抑制劑Necrostatin-1，和凋亡抑制劑Z－VAD－FMK處理24h后，細胞活力分別上升71.39%，59.71%，59.45%和55.73%。而鐵死亡抑制劑Fer-1對細胞活力的改善效果優(yōu)于其他抑制劑組，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明鐵死亡在高糖高脂造成的MIN6胰島β細胞的功能損傷中扮演著至關重要的作用。

2.2 Fer-1對高糖、高脂誘導的MIN6胰島β細胞中氧化指標MDA，SOD，GSH的影響

經(jīng) GP處理24h后，與對照組相比，MIN6細胞內(nèi) GSH 含量和 SOD 活力顯著降低（P<0. 05）；MDA含量顯著上升（P<0. 05），加入 Fer-1 處理后，與GP相比，細胞內(nèi) GSH 含量和 SOD 活力顯著升高，同時MDA含量明顯降低（P<0. 05），見圖2。

2.3 Fer-1對高糖、高脂誘導的MIN6胰島β細胞中Fe2+的影響

Fer-1對高糖、高脂誘導的MIN6胰島β細胞中Fe2+的影響結(jié)果見圖3。

用Lillie試劑盒檢測細胞內(nèi)Fe2+含量，由圖3可知，經(jīng) GP處理24h后，與對照組相比，GP組MIN6 細胞內(nèi) Fe2+水平明顯升高（P<0. 05）；加入 Fer-1處理后得到改善，與GP相比，細胞內(nèi)Fe2+水平明顯降低（P<0. 05）。

2.4 Fer-1對高糖、高脂誘導的MIN6胰島β細胞中ROS水平的影響

DCFH－DA熒光探針檢測MIN6細胞內(nèi)ROS含量的變化，圖4 可知熒光顯微鏡結(jié)果顯示，細胞經(jīng)GP處理24h后，GP組熒光強度與對照組相比明顯增強，表明GP組 ROS的含量明顯高于正常組（P<0. 05）；經(jīng)過 Fer-1處理，與GP相比，熒光強度明顯降低（P<0. 05），表明ROS的積累水平明顯降低。

2.5 GSPE通過抑制鐵死亡保護高糖高脂誘導的MIN6細胞功能損傷

為了觀察GSPE對高糖高脂誘導的細胞損傷的保護作用，本次實驗檢測了不同濃度的GSPE對高糖高脂造成的細胞活力的影響。

圖5結(jié)果表明，不同濃度GSPE處理后，MIN6細胞死亡數(shù)量顯著降低，細胞活力得到明顯改善（P<0. 05）。改善效果呈明顯的劑量效應關系，高劑量GSPE改善效果優(yōu)于Fer-1處理組（P<0. 05）。接下來，評估了MIN6細胞所表現(xiàn)出的形態(tài)學變化，在正常條件下培養(yǎng)的MIN6細胞呈多邊形，與其他細胞緊密相連。經(jīng)高糖、高脂處理后，細胞形狀更不規(guī)則，尖端突出，貼壁細胞數(shù)量減少，細胞附著松散，呈圓形，與鐵死亡的形態(tài)學特征相似。GSPE和Fer-1處理效果相同；死亡細胞粘附減少，貼壁細胞數(shù)量增加，細胞恢復正常形態(tài)（圖6）。由圖6 PI染色結(jié)果可知，對照組發(fā)生死亡的細胞數(shù)量明顯低于GP處理組。

2.6 GSPE和Fer-1對高糖、高脂誘導的MIN6胰島β細胞中鐵死亡關鍵蛋白ACSL4和GPX4蛋白表達的影響

由圖7可知，在長期暴露于高糖、高脂的MIN6胰島細胞中鐵死亡關鍵蛋白ACSL4表達水平顯著上調(diào)（P<0.05），GPX4表達水平顯著下調(diào)（P<0.05），而GSPE干預后顯著改善了這兩個關鍵性蛋白的表達水平（P<0.05），改善程度近似與Fer-1組。結(jié)果表明GSPE可能通過抑制細胞發(fā)生鐵死亡來改善MIN6胰島細胞功能。

2.7 GSPE通過激活Xc-/GPX4信號通路來保護高糖高脂誘導的MIN6細胞鐵死亡

Xc-/GPX4信號通路在鐵死亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。為了確定GSPE對高糖高脂誘導的鐵死亡是否通過激活Xc-/GPX4通路來實現(xiàn)，本次實驗評估了SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM在MIN6細胞的表達。如圖8所示，與對照組相比，GP組MIN6細胞中的SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM水平均低于對照組。這些結(jié)果表明，Xc-/GPX4通路可能參與了高糖高脂誘導的鐵死亡。施加不同劑量的GSPE處理提高了SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM的表達水平，改善效果近似與Fer-1處理組。表明GSPE對MIN6細胞的保護作用至少部分是通過激活Xc-/GPX4信號通路實現(xiàn)的。

3 討論

DM是目前面臨的最嚴重的全球健康問題之一，是一種以血糖水平升高為特征的進行性代謝綜合征，目前認為DM的發(fā)病機制主要是胰島β細胞功能受損，而由DM誘發(fā)的糖脂代謝紊亂又是胰島β細胞功能受損的主要誘因［8］。目前研究認為鐵死亡主要涉及到兩個方面。一是谷胱甘肽（GSH） 的消耗，二是谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4） 的活性降低［9］。GPX4 能夠降解脂質(zhì)過氧化物，在鐵死亡發(fā)生過程中對保護細胞免受氧化損傷起到關鍵作用。由于GSH是GPX4酶分解過氧化物過程中至關重要的輔助因子，降低GSH的含量，會導致GPX4的酶活性顯著降低，使得細胞清除脂質(zhì)過氧化物的能力下降。最終引起細胞膜氧化損傷，使得膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，誘導細胞發(fā)生鐵死亡［10］。迄今為止，只有少數(shù)研究探索了DM和鐵死亡之間的聯(lián)系，而沒有關于鐵死亡在高糖高脂誘導的胰島β細胞功能損傷中的作用的報道。目前的研究表明鐵死亡與糖脂毒性誘導的胰腺損傷中β細胞死亡有關。植物性食物在降血糖和DM防治中發(fā)揮著重要作用。植物性食物中的多酚類物質(zhì)作為植物性化合物可能通過充當鐵螯合劑減少GSH消耗，GPX4失活和脂質(zhì)過氧化進而抑制了MIN6細胞中的鐵蓄積和鐵死亡［11］。GSPE作為一種多酚類化合物，其抗氧化能力與其鐵螯合功能密切相關［6］，通過減輕細胞鐵死亡從而促進細胞功能的改善。此外，GSPE逆轉(zhuǎn)了鐵死亡的關鍵指標：GPX4和ACSL4的表達變化，并增加了Xc-/GPX4通路相關蛋白的表達。結(jié)果表明，GSPE激活Xc-/GPX4信號通路，拮抗糖脂毒性誘導的氧化損傷，抑制β細胞的鐵死亡。

GPX4是預防鐵死亡的主要酶。有證據(jù)表明，產(chǎn)生胰島素的細胞易受鐵死亡的影響，除非它們受到GPX4的保護［12］。近年來，越來越多的證據(jù)表明，過量的鐵也是引發(fā)鐵死亡的關鍵因素［4］。而鐵超載是DM的一個重要危險因素［13］；ACSL4是參與代謝相關疾病的關鍵因素［14］。研究表明［15］ACSL4和GPX4被認為是調(diào)節(jié)鐵死亡的主要成分。ACSL4被認為是鐵死亡的重要調(diào)控因子，而ACSL4的過表達促進了鐵死亡的發(fā)生發(fā)展［16］。因此，本研究選用高糖高脂刺激小鼠胰島β細胞株MIN6細胞，建立細胞受損的體外模型。探究鐵死亡在其中扮演的作用以及GSPE對MIN6細胞活性的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖高脂會造成細胞活性下降。鐵死亡是由于細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平明顯升高，而引發(fā)細胞發(fā)生的一種不同于其他類型的細胞死亡形式［17］。MDA作為反映機體脂質(zhì)氧化損傷程度的敏感性重要指標，而SOD是抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分之一，能直觀反應細胞抗氧化能力和過氧化水平［18］。GSH在維持細胞內(nèi)氧化還原平衡，減少氧化應激，減輕鐵死亡中發(fā)揮著不可或缺的作用［19］。本實驗結(jié)果顯示高糖高脂造成MDA含量明顯升高，SOD活力和GSH含量明顯降低，在加入Fer-1后，MDA、GSH和SOD活力發(fā)生顯著改善，基本恢復正常水平。結(jié)果說明鐵死亡抑制劑Fer-1對高糖高脂造成的細胞損傷有一定的保護作用。由過量的Fe2+介導芬頓反應會引起ROS積累，進而加速鐵死亡的進程。本次實驗對細胞內(nèi)Fe2+和ROS水平也進行了檢測。結(jié)果顯示高糖高脂不僅會引起鐵死亡關鍵蛋白的變化，也會導致Fe2+和ROS水平升高。

Xc-/GPX4通路上的Xc-系統(tǒng)是細胞膜上控制胱氨酸和谷氨酸進出的主要通道，包括輕鏈亞基（xCT，SLC7A11）和重鏈亞基（CD98hc，SLC3A2）兩個亞基組，其中SLC7A11在GSH的合成尤為重要，當SLC7A11的表達受到抑制時，會顯著減少細胞對胱氨酸的攝取，導致細胞抗氧化系統(tǒng)紊亂，進一步增加細胞對鐵死亡的敏感性。在鐵死亡中也可以通過調(diào)控Xc-/GPX4通路中關鍵物質(zhì) GSS、GCLM等來調(diào)控下游GSH的含量進而抑制ROS水平從而減緩鐵死亡的發(fā)生。本實驗用Western blot結(jié)果驗證Xc-/GPX4通路的關鍵蛋白表達水平，結(jié)果顯示高糖高脂組的蛋白表達水平有下降趨勢，在施加GSPE干預后，蛋白表達水平明顯上升，且高濃度GSPE作用效果與Fer-1組相似。

綜上所述，GSPE作為一種鐵螯合劑和抗氧化劑，改善細胞活性可能是通過抑制細胞發(fā)生鐵死亡來實現(xiàn)。其機制可能是GSPE通過激活Xc-/GPX4信號通路來抑制鐵死亡，從而減少DM中β細胞損傷和功能障礙。本研究為DM的防治以及植物化學物在DM中發(fā)揮的作用提供了一定的參考依據(jù)。

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（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-01-11

基金項目：中國博士后科學基金項目（2017M613310XB）；石河子大學科研項目（ZZZC201704A）

作者簡介：王同玲（1994—），女，碩士研究生，專業(yè)方向為天然產(chǎn)物對糖尿病的影響及其機制。

*通信作者：丁玉松（1979—），男，副教授，從事天然產(chǎn)物對糖尿病的影響及其機制，e－mail： 51603030@qq.com。