高麗　嚴文允　李茹超　魏楠楠　周文靜　白赟

摘要：目的 觀察防己黃芪湯對氣虛水負荷模型大鼠的利尿作用及腎臟水通道蛋白（Aquaporin，AQP）1～4表達的影響。方法 采用“游泳疲勞＋飲食失節(jié)”復合因素誘導制備氣虛大鼠模型，生理鹽水造成水負荷狀態(tài)，設防己黃芪湯低、中、高劑量組，另設空白對照組，每組10只。觀察各組大鼠一般狀態(tài)及體重變化，用顯微鏡觀察各組大鼠的腎臟病理變化，Real－Time PCR法和Western Blot法檢測各組大鼠腎臟AQP1～4的mRNA和蛋白表達。結果 給藥后，與模型組比較，防己黃芪湯中、高劑量組一般狀態(tài)良好，體重明顯增長（P<0.05）。腎臟病理檢測結果顯示，模型組有腎小管擴張化，其余各組未見異常變化。Real－Time PCR和Western Blot結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠腎臟組織AQP 1～4 mRNA和蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，防己黃芪湯中、高劑量組大鼠腎組織AQP 1～4 mRNA和蛋白表達明顯降低（P<0.05）。結論 防己黃芪湯對氣虛水負荷模型大鼠有明顯的利尿作用，這可能與下調(diào)腎AQP 1～4的mRNA和蛋白表達有關。

關鍵詞：防己黃芪湯；氣虛；鹽水負荷；水通道蛋白；利尿作用

中圖分類號：R285.5中圖分類號文獻標志碼：A文獻標識碼

Diuretic effect and the expression of AQP1～4 in kidney of Fangji Huangqi

decoction on rats with Qi－deficiency and saline－loading

GAO? Li，YAN? Wenyun，LI? Ruchao，WEI? Nannan，ZHOU ?Wenjing，BAI? Yun

（Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Jinzhong，Shanxi 030619， China）

Abstract：? Objective The study was to observe the diuretic effect and the expression of Aquaporin （AQP） 1～4 in kidney of Fangji Huangqi Decoction on rats with Qi－deficiency and saline－loading. Methods The model rats of Qi－deficiency were established by composite factors of exhaustive swimming and intemperance of taking food， which were given saline by intragastric administration. The model rats were randomly divided into model group and medication groups （high， middle and low dosage） of Fangji Huangqi Decoction. Another blank group was controlled. The changes of general state and body weight of rats in each group were observed. The pathological changes of kidneys were observed by microscope. Real－Time PCR was used to detect mRNA expression of AQP 1～4， and Western Blot was used to detect protein expression of AQP 1～4 in kidneys. Results After administration， compared with the model group， the middle and high dose groups of Fangji Huangqi Decoction were generally in good condition and their body weight increased significantly （P<0.05）. Renal pathological examination showed that tubule expansion could be observed in the model group， while no obvious abnormal changes in the other groups. Compared with blank group， mRNA and protein expression of AQP 1～4 in model group were increased significantly （P<0.05）. Compared with the model group， mRNA and protein expression of AQP 1～4 in middle and high dose group of Fangji Huangqi Decoction were decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Fangji Huangqi decoction could significantly improve and regulate water metabolism in rats of Qi－deficiency and Saline－loading， and down－regulating mRNA and protein expression of AQP 1～4 in renal might be one of its action mechanisms.

Key words： Fangji Huangqi decoction;Qi deficiency;saline loading;aquaporin;diuretic effect

防己黃芪湯是源自《金匱要略》的經(jīng)典名方，由防己、黃芪、白術、炙甘草、生姜、大棗組成，功效益氣健脾，利水消腫。根據(jù)方證相關理論，防己黃芪湯正對氣虛水腫之證。臨床上，防己黃芪湯加減用來治療多種水液代謝相關疾病，如腎病綜合征［1］、心力衰竭［2］、高血壓［3］等，凡辨證屬氣虛的，均療效顯著?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白（aquaporin，AQP）是位于細胞膜上的一種特殊蛋白，負責運輸水及一些小分子通過細胞內(nèi)外，具有高度選擇性，以維持組織器官甚至全身水平衡。目前為止，已發(fā)現(xiàn)13種同工型AQP，在腎臟中發(fā)現(xiàn)9種（AQP1～AQP8和AQP11），其中，AQP1～4在尿液形成中起著重要作用。故本實驗選擇氣虛水負荷模型大鼠來研究防己黃芪湯對腎AQP1～4表達的影響，以期為防己黃芪湯的臨床應用和理論研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Wistar大鼠70只，SPF級，雄性，體重（200±20）g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。

1.1.2 儀器與設備

TE612-L電子天平（梅特勒-托利臺儀器上海有限公司），KDC－OHR高速冷凍離心機（安徽中科中佳科技儀器有限公司），Spectra Max190型酶標儀（美國，MD公司），ImageQuant LAS 500一體化成像儀（美國GE公司），BG－PS電泳儀（生工生物工程（上海）股份有限公司），QuantStudioTM5熒光定量PCR儀（賽默飛）。

1.1.3 藥品與試劑

黃芪飲片購自安徽精誠本草中藥飲片有限公司，批號為20201001，防己飲片、炙甘草飲片、白術飲片購自北京同仁堂股份有限公司，批號分別為20200801、20201001、20201201。Na、K、Cl測試盒購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20211123、20211110、20211029。AQP1、AQP2抗體、HRP-羊抗兔IgG均購自博士德公司，批號分別為ZP2009BP09、ZP2010BP10、BST16I26C16J54；AQP3、AQP4抗體均購自ABclonal，批號分別為0058560102、0073660202。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 氣虛模型的建立

實驗前全部動物進行負重（在鼠尾纏繞約體重7%的鐵絲）游泳，水溫20±2 ℃，篩選時長為10～30 min內(nèi)的動物繼續(xù)實驗。按照數(shù)字隨機法將大鼠分為兩組，正常組和氣虛模型組。其中正常組按常規(guī)喂養(yǎng)，不做任何處理；氣虛模型組參照《中藥治療脾虛證的臨床研究指標原則》［4］和《中醫(yī)濕病學》［5］，采用“游泳疲勞＋飲食失節(jié)”復合因素誘導建立。具體操作為采用隔日禁食、隔日給食及每日負重游泳，直至口鼻沒入水中3～4 s撈出，連續(xù)4周。

1.2.2 防己黃芪湯的制備

防己黃芪湯參照原書比例，按防己：黃芪：白術：甘草=4∶5∶3∶2進行前煮，煎煮時再加入生姜、大棗。將藥材以10倍體積的水浸泡2 h，用武火煮沸，繼續(xù)文火煎煮30 min。第二次用8倍水體積浸泡，以相同方法煎煮，合并兩次的過濾液，蒸餾濃縮至所需要的濃度。靜置冷卻后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實驗分組與給藥

造模成功后，將40只氣虛水負荷模型大鼠按照數(shù)字隨機法分為4組，即模型組、防己黃芪湯低劑量組、防己黃芪湯中劑量組、防己黃芪湯高劑量組，每組10只。另設空白對照組10只。各組大鼠分別按2 mL/100g的灌胃體積進行灌胃?？瞻讓φ战M、模型組大鼠灌服生理鹽水；防己黃芪湯低、中、高劑量組分別灌服為2.20、4.40、8.80 g·kg-1的劑量防己黃芪湯，連續(xù)7天。

1.2.4 標本采集與保存

每組大鼠按生理鹽水50 mL·kg-1灌胃造成水負荷，30 min后，收集每小時尿液，連續(xù)收集6 h。3 000 r·min-1離心15 min，取上清，進行尿Na+、K+、Cl-含量測定pH值的測定。尿液收集結束后以10%水合氯醛麻醉各組大鼠，摘取腎臟，除去包膜，把一側放入裝有組織固定液的標本瓶中固定，以制備病理切片；另一側置于-80 ℃冰箱保存，以備Na+-K+-ATP酶檢測和RNA及蛋白質的提取。

1.2.5 腎Na+-K+-ATP酶活力的檢測

取腎組織放入勻漿管中，加入0.9%的生理鹽水作為勻漿介質，制成10%的勻漿液，用低速離心機2 500 r·min-1離心10 min，取上清按說明書進行測定。

1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測大鼠腎組織AQP1～4的蛋白表達

取適量腎組織，加入蛋白裂解液，勻漿制備腎組織蛋白勻漿液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。稀釋至同一濃度進行蛋白變性，上樣，跑電泳，轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液進行封閉2 h；加入含AQP1、AQP2、AQP3、AQP4一抗、β-actin內(nèi)參的TBST稀釋液進行4℃孵育過夜；搖床洗脫3次/10min；加入含二抗（1∶5 000）TBST稀釋液繼續(xù)孵育1h，搖床洗脫3次/10min；用化學發(fā)光試劑和一體化成像儀進行顯影曝光，用image－j分析其灰度值。

1.2.7 Real Time－PCR檢測大鼠腎組織AQP1～4的mRNA表達

取適量腎組織，按照RNA快速提取試劑盒提取RNA，用紫光分度計檢測其濃度。稀釋至同一濃度，按照試劑盒進行反轉錄實驗，再進行Real－Time PCR擴增，實驗步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.8 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布用均數(shù)±標準差（X-±S）表示，組間差異的比較采用單因素方差分析，在方差齊的情況下，多組間比較采用LSD－t檢驗，方差不齊的情況下，用Dunnetts T3作進一步的分析。以P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況的觀察

空白對照組大鼠食欲好，反應靈敏，皮毛光澤，大便正常，一般情況良好。氣虛模型組大鼠第1周開始出現(xiàn)食量下降，第2周出現(xiàn)倦怠少動、眼睛迷離、自主活動降低、蜷縮，皮毛少光；第3周開始出現(xiàn)皮毛干枯、蓬亂，糞便時軟時溏；第4周時，大鼠身體瘦弱，精神不振，瞇眼，弓背，爪色及耳色偏淡。大鼠體重、6 h總尿量、游泳時長結果見表2。

給藥治療后，與模型組相比，防己黃芪湯各組大鼠的食欲漸增、精神狀態(tài)良好、糞便形態(tài)有所改善，皮毛不似之前干枯。與模型組比較，防己黃芪湯各組的體重有所增加，結果見表3。

2.2 對大鼠各時間點及6 h總尿量的影響

與模型組比較，防己黃芪湯各劑量組在第2 h的尿量明顯增加（P<0.05），中劑量組在第2、3 h的尿量明顯增加（P<0.05），高劑量組在第2 h至第6 h的尿量持續(xù)明顯增加（P<0.05）。與空白對照組比較，模型組、防己黃芪湯低、中劑量組6 h總尿量明顯減少（P<0.05）；防己黃芪湯高劑量組大鼠的6 h總尿量明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，防己黃芪湯中、高劑量組大鼠的6 h總尿量明顯增加（P<0.05），結果見圖1。

2.3 對大鼠尿液Na+、K+、Cl-含量和pH值的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠尿Na+、K+、Cl-含量明顯降低（P<0.05），防己黃芪湯低劑量組大鼠的尿Na+、Cl-含量明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，防己黃芪湯中、高劑量組大鼠的尿Na+、Cl-含量明顯升高（P<0.05）；防己黃芪湯高劑量組大鼠的尿K+含量明顯升高（P<0.05）。各組大鼠尿液pH值比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05），結果見圖2。

2.4 對大鼠腎Na+-K+-ATP酶活力的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠腎Na+-K+-ATP酶活力明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，防己黃芪湯中、高劑量組大鼠的腎Na+-K+-ATP酶活力明顯升高（P<0.05），結果見表4。

2.5 對大鼠腎組織病理的影響

腎臟病理學觀察顯示，正常組及防己黃芪湯各治療組大鼠皮質髓質分界明顯；皮質腎小球分布均勻，腎小球中細胞數(shù)量以及基質均勻；髓質未見明顯異常；腎間質無明顯增生；未見明顯的炎性改變。模型組大鼠的腎皮質局部可見少量腎近曲小管擴張，結果見圖3。

2.6 對大鼠腎組織AQP1、2、3、4蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠腎組織AQP1、2、3、4蛋白表達明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，防己黃芪湯低劑量組大鼠腎AQP1蛋白表達明顯降低；中、高劑量組大鼠腎AQP1、2、3、4蛋白表達明顯降低（P<0.05），結果見圖4和圖5。

2.7 對大鼠腎組織AQP1、2、3、4 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠腎AQP1、2、3、4 mRNA表達含量明顯增高（P<0.05）。與模型組比較，防己黃芪湯低劑量組大鼠腎AQP2、3 mRNA表達含量明顯降低（P<0.05）；中、高劑量組大鼠腎AQP1、2、3、4 mRNA表達含量明顯降低（P<0.05）。見圖6。

3 討論

本項目從方證相關角度對經(jīng)典名方藥效作用機制進行研究。方證相關是指一個方劑內(nèi)的藥味及其配伍關系與其針對的病證病機或病理環(huán)節(jié)之間具有高度相關性或針對性。方證相關強調(diào)了方藥與其作用對象之間的相互作用，即方劑的功用是特定方藥與其作用對象特定證之間相互作用的結果，方藥-機體（病證）的密切關聯(lián)是中醫(yī)辨證論治中的重要特征。防己黃芪湯益氣健脾、利尿消腫，正對氣虛水腫之證。本實驗采用單日禁食、雙日給食結合約7%的負重游泳疲勞法制備氣虛模型，再施以水負荷刺激制備氣虛水負荷模型大鼠，符合氣虛水腫之中醫(yī)證型。

中醫(yī)理論認為水液代謝是由肺、脾、腎等多臟腑參與的復雜生理活動，是臟腑生理功能的協(xié)調(diào)綜合作用?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)AQP在肺、腎、消化系統(tǒng)等器官廣泛分布，起到介導水跨膜轉運的作用，是維持體內(nèi)水液代謝平衡的分子學基礎。這提示我們，將AQP與水液代謝密切的關系，與中醫(yī)理論的肺、脾、腎等功能聯(lián)系起來，可以為中醫(yī)藥的發(fā)展提供理論基礎與實驗依據(jù)。

在腎組織中，已發(fā)現(xiàn)9種AQP分別在腎臟不同部位、不同細胞表達，以維持正常的尿液濃縮功能，組織發(fā)育和物質代謝等。研究最多的是AQP1～4，它們是參與水的重吸收和尿液濃縮的主要通道［6］。AQP1位于近端小管上皮細胞的頂質膜、髓袢降支細段管腔膜及直小血管降部，負責腎小管水分子的重吸收，敲除掉AQP1的轉基因小鼠，在腎近端小管對水的通透性降低，會阻礙腎小球濾過的水的重吸收，表現(xiàn)出多尿［7-8］。AQP2位于集合管根尖和基底外側膜及根尖下囊泡中，在維持水平衡、調(diào)節(jié)體液體積及滲透壓方面起著至關重要的作用，是參與水重吸收的關鍵AQP，AQP2基因突變或缺陷會導致尿液濃度的缺陷［9］。AQP3分布在集合管上皮細胞基底膜外側，除了水外，AQP3還能轉運小分子，如甘油和尿素；AQP4主要存在于集合管中，以內(nèi)髓部分為主，參與水的重吸收和尿液的濃縮［10-11］。

腎小管和集合管中AQP表達增多，則會有大量的水重吸收，進而導致尿量的減少及尿液濃縮。而實驗研究證實中醫(yī)藥治療水液代謝紊亂方面的疾病可通過調(diào)節(jié)AQP的表達來實現(xiàn)，如車前子提取物［12］、茯苓［13］通過下調(diào)AQP1，AQP2的表達實現(xiàn)利水作用；水梔子的利尿作用與下調(diào)AQP2，AQP3相關［14］；真武湯通過下調(diào)腎AQP2的表達改善水液失衡問題［15］；五苓散通過降低腎AQP 1～4的表達實現(xiàn)治療水液代謝疾病［16-19］。

防己黃芪湯源自《金匱要略》，是益氣利水的經(jīng)典名方，由祛風利水的防己和健脾利水的黃芪共為君藥，伍以“健脾燥濕第一要藥”白術，調(diào)和諸藥的炙甘草，佐加生姜、大棗而成。防己黃芪湯在臨床上常用于治療和氣虛有關的水液代謝紊亂疾病，療效突出。本實驗研究結果顯示，氣虛水負荷模型大鼠腎AQP 1、AQP2、AQP3、AQP4 mRNA及蛋白含量高度表達，可能使腎臟水液重吸收功能加強，從而減少尿量、破壞電解質平衡，這可能是加速機體水腫發(fā)展的因素之一。而防己黃芪湯有顯著的利尿作用，可能是通過下調(diào)腎AQP 1、AQP2、AQP3、AQP4 mRNA和蛋白過度表達，促進水鈉的排放，增加尿量而實現(xiàn)的。這些結果可為防己黃芪湯益氣健脾、利水消腫的作用提供了實驗依據(jù)，也可為進一步說明防己黃芪湯與氣虛水腫證之間的方證相關提供理論依據(jù)。

防己黃芪湯藥物組成不算復雜，但中藥有效成分眾多，有關該方化學成分方面的研究主要有陳萌等［20］采用HPLC－UV/ELSD進行了防己黃芪湯指紋圖譜研究，關皎等［21］采用高效液相色譜法測定了防己黃芪湯中粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白術內(nèi)酯Ⅰ6種成分的含量。另有李燕子等［22］檢測了防己黃芪湯中黃芪甲苷含量，劉幸平等［23］檢測了防己黃芪顆粒劑中防己諾林堿、粉防己堿的含量。防己黃芪湯全方在體內(nèi)的藥物代謝動力學過程也尚不明確，主要研究成果集中于山西大學秦雪梅教授團隊，他們采用UHPLC－Q-TOF－MS分析了防己黃芪湯作用于阿霉素腎病大鼠的血漿樣本，共鑒定出原型25種，代謝物50種，同時通過DAS 2.0軟件擬合了防己黃芪湯中20種原型及6種代謝物的藥代動力學曲線，表明黃酮類及皂苷類化合物的達峰時間在1～3 h，生物堿類化合物的達峰時間在5～8 h，防己黃芪湯有效成分的半衰期為6.619 h［24］。中藥療效確切，具有多成分、多靶點、整合調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，但中藥的藥效物質基礎及作用機理不明確使中藥國際化受到很大限制。今后有關防己黃芪湯的研究也可在藥物代謝方面開展，以探求防己黃芪湯在體內(nèi)的動態(tài)規(guī)律，促進防己黃芪湯藥效物質基礎、藥效作用機制的研究。

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（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-05-27

基金項目：山西省自然基金項目（201901D111338）；山西中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新能力培育計劃項目（2019PY-120）；山西中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（2021CX010）

作者簡介：高麗（1977—），女，副教授，從事方劑效用及其物質基礎研究，e－mail：342014263@qq.com。