杜云峰 姜慧嬌 劉程豪 侯卜文 舒敏 黎廣 陳雪玲 吳向未
摘要:目的 體內(nèi)外實驗探討舒尼替尼聯(lián)合阿苯達唑抗泡狀棘球蚴活性。方法 體外對應(yīng)藥物濃度培養(yǎng)原頭節(jié)后鏡下觀察其活性并計算成活率;腹腔感染泡狀棘球蚴小鼠治療60 d后,稱量囊濕重并計算抑囊率。試劑盒檢測AST、ALT、 IL-2,IL-4水平。HE觀察病理學(xué)改變,免疫組化檢測CD4、CD34表達水平。結(jié)果 體外培養(yǎng)第7 d ABZ+SU11248組原頭節(jié)存活率(45.168%±3.903%)低于ABZ組(59.198%±1.894%)和SU11248組(69.232%±3.673%);ABZ+SU11248組的囊濕重(2.566±1.080)g低于 ABZ組(4.519±0.4934)g,SU11248(5.384±0.6586)g組和Control組(10.25±1.979)g;ABZ+SU11248組抑囊率74.94%高于ABZ組55.91%和SU11248組47.47%;ABZ+SU11248組ALT、AST水平中低于其他給藥組,IL-2、IL-4水平較其他給藥組明顯升高。ABZ+SU11248組原頭節(jié)畸形改變,角質(zhì)層變薄,生發(fā)層紊亂。ABZ+SU11248組免疫組化CD4評分(10.13±1.46)高于Control組(4.00±1.07)和ABZ組(6.50±3.34);CD34評分(1.88±1.25)低于Control組(6.38±1.85),ABZ組(6.63±1.69)和SU11248組(4.25±1.17)。結(jié)論 舒尼替尼能夠通過抑制血管新生來抑制泡狀棘球蚴的生長,其與阿苯達唑聯(lián)合治療比二者單獨治療對泡狀棘球蚴活性抑制作用更強且造成更低的肝損傷。
關(guān)鍵詞:泡狀棘球蚴;阿苯達唑;舒尼替尼;聯(lián)合用藥
中圖分類號:中圖分類號R532.32文獻標志碼:A文獻標識碼
Sunitinib in combination with albendazole for the treatment of alveolar echinococcosis
DU? Yunfeng 1,JIANG? Huijiao1,LIU Chenghao1,HOU Bowen1,SHU Min1,LI? Guang1,CHEN Xueling2,WU? Xiangwei 1,3*
(1 School of Medicine,Shihezi University/NHC Key Laboratory of Prevention and Treatment of Central Asia High Incidence Diseases,
Shihezi,Xinjiang 832000, China; 2 Department of Immunization, School of Medicine,
Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000, China; 3 Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of
Medical College,Shihezi University, Shihezi,Xinjiang 832000, China)
Abstract:? Objective To investigate the anti-alveolar echinococcosis activity of sunitinib combined with albendazole in vitro and in vivo. Methods The activity was observed and the survival rate was calculated under the posterior microscope after cultured with the corresponding drug concentration in vitro. After 60 days of treatment, the wet weight of the cyst was measured and the rate of cyst inhibition was calculated. AST, ALT, IL-2 and IL-4 levels were detected by the kit. The pathological changes were observed by HE, and the expression levels of CD4 and CD34 were detected by immunohistochemistry. Results The survival rate of alveolar echinococcosis protoscoleces in ABZ+SU11248 group (45.168%±3.903%) was lower than that in ABZ group (59.198%±1.894%) and SU11248 group (69.232%±3.673%) on the 7th day of culture in vitro. The wet weight of capsule in ABZ+SU11248 group (2.566±1.080) g was lower than that in ABZ group (4.519±0.4934) g, SU11248 group (5.384±0.6586) g and Control group (10.25±1.979) g. The rate of sac inhibition in ABZ+SU11248 group 74.94% was higher than that in ABZ+SU11248 group 55.91% and SU11248 group 47.47%. The levels of ALT and AST in ABZ+SU11248 group were lower than those in other administration groups, and the levels of IL-2 and IL-4 were significantly higher than those in other administration groups. ABZ+SU11248 group was characterized by malformation, thinning of cuticle layer and disorder of germinal layer. Immunohistochemical CD4 score in ABZ+SU11248 group (10.13±1.46) was higher than that in Control group (4.00±1.07) and ABZ group (6.50±3.34). The score of CD34 (1.88±1.25) was lower than that of Control group (6.38±1.85), ABZ group (6.63±1.69) and SU11248 group (4.25±1.17). Conclusion Sunitinib can inhibit the growth of alveolar echinococcosis by inhibiting angiogenesis. The combination of Sunitinib and albendazole has a stronger inhibitory effect on the activity of alveolar echinococcosis and causes less liver damage than the two treatments alone.
Key words: echinococcus alveolaris;albendazole;sunitinib;combination of drugs
棘球蚴病(Echinococciosis)一種人與動物之間的傳染病,主要由棘球蚴的幼蟲感染引起。其特征是細粒棘球蚴感染所引起的囊型包蟲?。‥chinococcus granulosus,CE),以及多房棘球蚴所引起的泡狀棘球蚴?。ˋlveolar Echinococcosis,AE)[1]。人類常因誤食蟲卵而被感染,在人體內(nèi)的泡狀棘球蚴隨著血液運輸至肝臟且在此定居引發(fā)肝泡狀棘球蚴?。℉epatic alveolar echinococcosis,HAE)[2]。臨床上肝泡狀棘球蚴病通常以腫瘤的形式發(fā)展,即所謂的“寄生蟲型肝癌”,如未及時治療,90%的患者在確診后10~15年之內(nèi)就會死亡[3]。阿苯達唑(Albendazole,ABZ)是治療泡球蚴病的一線藥物,用于外科手術(shù)后的輔助治療和姑息療法,長期使用ABZ會產(chǎn)生嚴重的不良反應(yīng)和耐藥性[4]。
泡狀棘球蚴的侵襲、生長和轉(zhuǎn)移的重要機制與血管新生相關(guān)[5]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF) 在組織損傷、缺氧、炎癥等環(huán)境中的表達增強,與血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR1-3)結(jié)合在促進新血管生成和淋巴管生成中起重要作用[6-7]。泡狀棘球蚴感染時,因寄生蟲的存在,會使宿主細胞不斷產(chǎn)生VEGFA[8]、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)[9-10]和基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP2)[11],從而使其產(chǎn)生無法控制的血管新生。血管調(diào)節(jié)因子CD34是一種高度糖基化的I型糖蛋白,在人體和其它哺乳動物的血液中選擇性表達[12]。CD34介導(dǎo)的黏附信號[13]是由酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase,TPK)所決定的,TPK特異性的抑制劑能阻止細胞的黏附。阿苯達唑是世界衛(wèi)生組織推薦的治療棘球蚴病的一線藥物之一,通過抑制蟲體攝取葡萄糖,使蟲體生發(fā)層細胞糖原耗竭、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小體和線粒體變性,溶酶體增加,最終導(dǎo)致蟲體死亡。能改善患者的生活品質(zhì)并延長壽命。但存在胃腸道吸收率較低、半衰期較短、生物利用度低等,這些缺點使阿苯達唑難以在體內(nèi)達到有效的血藥濃度[14]。舒尼替尼(Sunitinib,SU11248)是一種多靶向酪氨酸激酶抑制劑,它可以選擇性地針對多個酪氨酸激酶受體(Receptor tyrosine kinases,RTK)來治療消化道基質(zhì)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腎癌。RTK在細胞生長的調(diào)節(jié)中起重要作用,突變或過度表達的RTK與多種人類癌癥有關(guān)[15]。舒尼替尼可逆轉(zhuǎn)免疫抑制,治療荷瘤小鼠時發(fā)現(xiàn)IL-10、TGF-β和Foxp3的表達降低,CD4和CD8細胞的百分比和浸潤程度明顯更高[16]。抑制VEGF信號途徑可以抑制腫瘤的生長,血管新生和轉(zhuǎn)移[17-19]。臨床上對于舒尼替尼的不良反應(yīng)有血細胞計數(shù)減少(特別是白細胞)、腹瀉、疲勞、惡心等癥狀[20]。因此我們希望能探索一種新的藥物劑量或改良給藥方式在降低阿苯達唑和舒尼替尼藥物不良反應(yīng)的同時還能達到較好的治療效果。
1 材料與方法
1.1 主要實驗動物及來源
泡狀棘球蚴腹腔感染6月的沙鼠購自新疆維吾爾地區(qū)疾控中心。雌性C57BL/6小鼠購于北京福貝斯公司,體重(20±2)g、6~8 周齡[動物生產(chǎn)許可證號:SCXK (京)2019-0030],在SPF級實驗動物房飼養(yǎng)。
1.2 主要試劑
舒尼替尼(Sunitinib,SU11248)、阿苯達唑(Albendazole,ABZ)購于美國APExBIO公司;DMEM高糖培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、10%胎牛血清、青鏈霉素、購于美國Life-Gibco公司;伊紅染液購于中國北京索來寶公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒購于中國南京建成公司;Anti-CD4、Anti-CD34抗體、IL-2 ELISA Kit檢測試劑盒、IL-4 ELISA Kit檢測試劑盒購于美國Abcam公司。
1.3 方法
1.3.1 泡狀棘球蚴原頭蚴的提取與活性鑒定
無菌操作取已保種泡狀棘球蚴沙鼠腹腔中泡球蚴組織,進行洗滌、剪切、研磨、過濾、沉淀,重復(fù)3次。取10 μL懸浮液滴于玻片上,用0.1%伊紅染液對泡狀棘球蚴進行染色,染色率<5%,泡狀棘球蚴活性好。一部分泡狀棘球蚴原頭節(jié)放入含青霉素和鏈霉素各100 U·mL-1和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后用于體外試驗;另一部分泡狀棘球蚴加無菌生理鹽水配制成20%混合液用于體內(nèi)實驗。
1.3.2 實驗分組及治療方案
將體外實驗分5組:Blank組(空白對照組)、DMSO組(溶劑對照組)、25 μg·mL-1 ABZ組(阿苯達唑粉劑組)、50 ng·mL-1 SU11248組(舒尼替尼組)[21],25 μg·mL-1 ABZ+50 ng·mL-1 SU11248(阿苯達唑粉劑聯(lián)合舒尼替尼粉劑組)。按上述濃度配制各組培養(yǎng)基,加入6孔板中,每孔加入體外已培養(yǎng)2d的泡狀棘球蚴原頭節(jié)約5 000個,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24h取原頭節(jié)用0.1%伊紅染液鑒定其活性,操作重復(fù)3次,泡狀棘球蚴原頭蚴活性率%=(未染色的泡狀棘球蚴原頭節(jié)數(shù)量/泡狀棘球蚴原頭節(jié)總數(shù)量)×100%;將40只腹腔接種泡狀棘球蚴的C57BL/6小鼠隨機分成5組:Blank組(空白對照組)、Control組(模型對照組)、ABZ組(阿苯達唑粉劑組)、SU11248組(舒尼替尼粉劑組)、ABZ+SU11248組(阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼粉劑組),每組8只。阿苯達唑給藥濃度為100mg·kg-1,舒尼替尼給藥濃度為50mg·kg-1,聯(lián)合用藥組為每天單藥交替給藥,給藥方式均為經(jīng)口灌胃。給藥治療60d后取各組小鼠血清、肝臟、腹腔泡狀棘球蚴組織備用。
1.3.3 檢測小鼠血清AST、ALT水平
各組C57BL/6小鼠于離心機中12 000 r·min-1離心后,取上清液,按照谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒說明進行檢測。
1.3.4 ELISA檢測小鼠血清中IL-2、IL-4水平
取小鼠上清液,按照測Mouse IL-2 ELISA Kit檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)、Mouse IL-4 ELISA Kit檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)說明進行檢測。
1.3.5 泡狀棘球蚴組織病理學(xué)變化及CD4、CD34水平檢測
取出泡狀棘球蚴組織后用4%多聚甲醛固定組織48 h,石蠟包埋切片,對組織進行HE染色,顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化。以CD4(1∶1 000),CD34 (1∶2 000)抗體作為一抗,免疫組織化學(xué)檢測泡狀棘球蚴組織CD4、CD34表達水平,評判標準參考文獻[22]。細胞質(zhì)不顯色或者顯示不清記 0分,淺黃色記1分,黃色記2分,棕黃色記3分;選3個視野,高倍鏡下每個視野計數(shù)細胞200個,計算陽性細胞百分率:<5%記0分,6%~25%記1分,26%~50%記2分,51%~75%記3分,>76%記4分。
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析
利用SPSS 25.0軟件對上述各項實驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析,分析結(jié)果統(tǒng)一用均數(shù)±標準差(X±S)表示;多組之間的比較采用單因素方差分析(ANOVA),結(jié)果顯示P<0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1.5 倫理批準
本研究經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理審查會批準 (批準號為 A2018-166),不涉及患者知情同意。
2 結(jié)果
2.1 聯(lián)合用藥對體外泡狀棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)的影響
從給藥第三天開始,隨著給藥時間增加,鏡下可見泡狀棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)發(fā)生明顯改變。Blank組和DMSO組鏡下原頭節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,有活動,伊紅染液不染色,表明其活性良好。ABZ組,SU11248組和ABZ+SU11248組鏡下原頭節(jié)表現(xiàn)為不同程度的伊紅著色。在ABZ+SU11248組中明顯發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間加長,鏡下原頭節(jié)染色程度加深,結(jié)構(gòu)紊亂,吸盤外翻,活力下降易被伊紅染色(圖1)。
2.2 聯(lián)合用藥顯著抑制體外泡狀棘球蚴原頭節(jié)的活性
泡狀棘球蚴原頭節(jié)在各組藥物治療1~7 d中,每24 h用0.1%伊紅染色計算原頭節(jié)生存率。重復(fù)測量后方差分析,各給藥組原頭節(jié)存活率與對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,隨著給藥時間增加,原頭節(jié)活性逐步下降(F=804.9,P <0.05)(圖2A)。在第7 d發(fā)現(xiàn)Blank組、DMSO組,ABZ組和SU11248組的泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力為(97.357%±0.903%)、(97.133%±0.696%)、(59.198%±1.894%)、(69.232%±3.673%),與ABZ+SU11248聯(lián)合組泡狀棘球蚴原頭節(jié)活力(45.168%±3.903%)相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=480,P <0.001)。隨著給藥時間的增加,ABZ+SU11248聯(lián)合用藥組對泡狀棘球蚴原頭蚴的活力抑制作用更明顯(圖2B)。
2.3 聯(lián)合用藥顯著抑制小鼠體內(nèi)泡狀棘球蚴的生長
Control組的泡狀棘球蚴囊泡較大,數(shù)目多,呈菜花樣,囊壁有較高的張力,其表面可見新生血管形成。ABZ+SU11248組的囊泡較其他組小,數(shù)目少,囊壁張力低,其表面少見血管新生(圖3A)。ABZ+SU11248組小鼠囊濕重為(2.566±1.080)g低于Control組(10.25±1.979)g,低于ABZ組(4.519±0.4934)g和SU11248組(5.384±0.6586)g(P <0.05)。ABZ+SU11248組囊泡的抑制率為74.94%,高于ABZ組55.91%和SU11248組47.47%(P <0.05),ABZ組與SU11248組囊濕重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
2.4 聯(lián)合用藥對小鼠肝損傷更低
小鼠血清ALT濃度中的Blank組與Control組、ABZ組,SU11248組和ABZ+SU11248組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.17,P <0.001)。ABZ+SU11248組小鼠血清ALT濃度(51.73±6.309)U·L-1低于Control組(83.36±10.65)U·L-1,低于ABZ組(73.96±10.26)U·L-1和SU11248組(72.67±7.758)U·L-1(P <0.05)(圖4A)。小鼠血清AST濃度中的Blank組與Control組、ABZ組,SU11248組和ABZ+SU11248組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.14,P <0.001),ABZ+SU11248組小鼠血清中AST濃度(96.60±9.880)U·L-1低于Control組(159.4±17.78)U·L-1和ABZ組(131.5±8.106)U·L-1和SU11248組(126.7±12.34)U·L-1(P <0.05)(圖4B)。
2.5 聯(lián)合用藥使小鼠血清IL-2、IL-4水平升高
ELISA檢測結(jié)果示:在IL-2表達水平中ABZ+SU11248組與Control組、ABZ組,SU11248組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=63.63,P <0.05),ABZ+SU11248組小鼠血清中IL-2濃度(171.00±9.502)U·L-1高于Control組(82.35±7.830)U·L-1,高于ABZ組(147.50±7.902)U·L-1和SU11248組(148.70±13.30)U·L-1(P <0.05),而與Blank組(170.40±11.22)U·L-1相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)(圖5A)。在IL-4表達水平中ABZ+SU11248組與Control組、ABZ組,SU11248組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.88,P <0.05),ABZ+SU11248組小鼠血清中IL-4濃度(63.10±4.946)U·L-1高于Control組(37.05±4.752)U·L-1,高于ABZ組(49.66±3.992)U·L-1和SU11248組(49.67±6.789)U·L-1(P <0.05),而與Blank組(67.64±6.916)U·L-1相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。
2.6 小鼠腹腔泡狀棘球蚴組織病理學(xué)觀察
伊紅染色下Control組可見明顯的原頭節(jié)生成,囊泡周圍的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)和生發(fā)層結(jié)構(gòu)清晰。ABZ組可見明顯的炎性細胞浸潤,囊泡內(nèi)原頭節(jié)呈發(fā)育不良的狀態(tài)。SU11248組角質(zhì)層變薄,囊泡內(nèi)原頭節(jié)也呈發(fā)育不良狀態(tài)。ABZ+SU11248組的炎性反應(yīng)帶變窄,且明顯可見囊泡生角質(zhì)層變薄,囊泡內(nèi)偶見少量畸形原頭節(jié)生成(圖6)。
2.7 聯(lián)合用藥腹腔泡狀棘球蚴組織中CD4水平高表達,CD34水平低表達
免疫組組化結(jié)果顯示,各組小鼠腹腔內(nèi)泡狀棘球蚴組織中均可檢測到CD4、CD34的表達。
ABZ+SU11248組的CD4評分結(jié)果與ABZ組和和Control組間相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.09,P<0.05),ABZ+SU11248組CD4評分(10.13±1.46)高于Control組(4.00±1.07)和ABZ組(6.50±3.34)(P<0.05)。ABZ+SU11248組與SU11248組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。ABZ+SU11248組的CD34評分結(jié)果與ABZ組,SU11248組和Control組間相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.08,P <0.05),ABZ+SU11248組CD34評分(1.88±1.25)低于Control組(6.38±1.85),低于ABZ組(6.63±1.69)和SU11248組(4.25±1.17)(P <0.05)。ABZ組泡狀棘球蚴CD34評分與Control組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖7)。
3 討論
泡狀棘球蚴病是一種人畜共患寄生蟲病,常因誤食多房棘球絳蟲蟲卵而被傳染的,其生物學(xué)行為與腫瘤類似,故有“蟲癌”之稱[23]。目前治療方式主要為根治性切除術(shù),對不能手術(shù)者行化療[4]。藥物治療主要為苯并咪唑類藥物,阿苯達唑是棘球蚴病的首選治療藥物,進入人體后轉(zhuǎn)化成為阿苯達唑亞砜從而發(fā)揮殺蟲作用,該藥在腸道的溶解性差,吸收度低,體內(nèi)廣泛分布,從而導(dǎo)致蟲體周圍藥物濃度不高,治愈難度大,但臨床治療效果欠佳,且需長期服藥,不良反應(yīng)風(fēng)險提高[24],急需開發(fā)新藥來提高療效。泡狀棘球蚴的生長依賴新血管的生成且血管中的養(yǎng)分能進一步促使泡狀棘球蚴生長發(fā)育,本次實驗通過使用舒尼替尼抑制血管生成的作用來觀察其對泡狀棘球蚴的原頭節(jié)的抑制作用。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)舒尼替尼對泡狀棘球蚴原頭節(jié)也存在抑制作用,具體機制有待進一步探究。在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼組的治療對泡狀棘球蚴生長抑制作用最強,泡狀棘球蚴囊泡周圍的角質(zhì)層顯著變薄,囊泡內(nèi)原頭節(jié)呈畸形發(fā)育。
在感染泡狀棘球蚴后各個治療組血清ALT、AST均升高,經(jīng)過藥物治療后發(fā)現(xiàn)阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼組的肝功指標較阿苯達唑組、舒尼替尼組和模型對照組均低,說明阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼用藥能有效抑制泡狀棘球蚴的生長從而降低其對肝臟的損傷。同時舒尼替尼組與阿苯達唑組的肝功指標相比無差異,表明舒尼替尼對小鼠無明顯藥物毒性作用。
在被泡狀棘球蚴感染時,輔助性T細胞1 (T helper type 1, Th1)細胞免疫應(yīng)答的激活與Th2細胞免疫應(yīng)答的激活不平衡,導(dǎo)致細胞因子的不同釋放。研究表明,藥物的治療效果可以通過監(jiān)測血清中IL-4的水平來評估[25-27],在泡狀棘球蚴感染的晚期IL-4水平的降低有利于泡狀棘球蚴囊泡的生長[28]在本實驗,模型對照組血漿IL-4含量顯著低于空白組,與之前的試驗結(jié)果相符[29-31]。既往實驗中發(fā)現(xiàn)在棘球蚴感染后期,IL-4水平和嗜酸性粒細胞百分比的升高有利于宿主[32]。IL-2是大多數(shù)感染性疾病中重要的炎癥和免疫應(yīng)答因子,具有增強宿主免疫,抑制腫瘤和寄生蟲生長的功能[33]。當受到泡狀棘球蚴感染時其會增加宿主體內(nèi)IL-2受體的表達使IL-2大量消耗,進而抑制了T淋巴細胞的免疫活性,并觸發(fā)泡狀棘球蚴的免疫逃逸[34]。本實驗中,模型對照組的IL-2低表達表明泡狀棘球蚴能降低宿主IL-2水平,符合既往實驗結(jié)果。與模型對照組相比,其余各給藥組均IL-2表達水平明顯升高,阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼組的IL-2水平高表達,證明聯(lián)合用藥能提高宿主的免疫應(yīng)答,其增強免疫能力比單藥模式效果更好。盡管對泡狀棘球蚴的免疫已經(jīng)有了一定的了解,但許多免疫機制仍不清楚,需進行更深入的研究。
伊紅染色下觀察到模型對照組有明顯的泡狀棘球蚴原頭節(jié)生成,囊泡內(nèi)可見完整的生發(fā)層其周圍可見清晰的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)。經(jīng)過用藥治療后發(fā)現(xiàn)舒尼替尼組能使泡狀棘球蚴囊泡周圍的角質(zhì)層變薄,而阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼組的囊泡中觀察到囊泡內(nèi)的原頭節(jié)成畸形改變,周圍角質(zhì)層明顯變薄。推測其原因是舒尼替尼組抑制血管生成阻斷營養(yǎng)物質(zhì)運輸而導(dǎo)致囊泡的角質(zhì)層發(fā)育不良而變薄,同時變薄的角質(zhì)層更有利于阿苯達唑的滲透從而更好的抑制泡狀棘球蚴的生長使其發(fā)育畸形。
CD34是最敏感的、具有最強抗原特異性的內(nèi)皮標記物,它被廣泛應(yīng)用于標記新生血管生成中的微血管和內(nèi)皮細胞[35]。本實驗研究中,CD34在聯(lián)合用藥組中表達最低,舒尼替尼組的CD34的表達低于模型對照組和阿苯達唑組且具有顯著性差異,表明舒尼替尼抑制酪氨酸激酶受體使CD34表達下調(diào),從而抑制血管內(nèi)皮細胞增生阻遏泡狀棘球蚴周圍新生血管生成。
CD4在人體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中起著重要作用,被稱為輔助T細胞,因其對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的顯著作用而被關(guān)注,研究表明促進CD4向Th1細胞分化后可抑制腫瘤生長[36]。實驗中阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼組的CD4表達水平明顯高于空白對照組、模型對照組,阿苯達唑組和舒尼替尼組,與既往結(jié)果一致。在腫瘤中舒尼替尼可活化Th1細胞增加CD4細胞浸潤[16]。CD4高表達向Th1分化能更好的抑制泡狀棘球蚴生長發(fā)育,然而其具體機制仍然不太清楚,尤其是那些涉及寄生蟲與宿主關(guān)系的機制,因為它們非常復(fù)雜。因此,需進一步深入研究這些機制。
綜上所述,在體外對泡狀棘球蚴原頭節(jié)進行給藥處理中,阿苯達唑與舒尼替尼聯(lián)合用藥既降低了給藥劑量又比單藥給藥對泡狀棘球蚴原頭節(jié)的活性的抑制效果更好,在對小鼠腹腔泡狀內(nèi)泡狀棘球蚴的治療中,阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼能更好抑制泡狀棘球蚴的生長,其囊泡內(nèi)的原頭節(jié)成畸形發(fā)育,治療效果比單藥模式更佳。阿苯達唑聯(lián)合舒尼替尼給藥模式降低劑量同時擁有更佳的治療效果,有望為泡狀棘球蚴病的治療與預(yù)后提供一種新的策略和理論依據(jù)。
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(責(zé)任編輯:編輯唐慧)
收稿日期:中文收稿日期2023-03-17
基金項目:國家自然基金項目(81760570),中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2020-PT330-003),新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團促進科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)計劃項目(2021BB006),新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團中青年領(lǐng)軍人才項目(2018CB017)
作者簡介:杜云峰(1997—),男,碩士研究生,專業(yè)方向為普通外科疾病研究。
*通信作者:吳向未(1973—),男,教授,博士生導(dǎo)師,從事肝膽外科良惡性疾病的臨床與基礎(chǔ)研究,e-mail: wxwshz@126.com。