劉兆慧，史寶利

（東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

花青素是一類(lèi)常見(jiàn)的天然色素，屬于多酚類(lèi)化合物[1]。自然界中的花青素一般不以游離態(tài)形式存在，常與1個(gè)或多個(gè)葡萄糖通過(guò)糖苷鍵連接形成花色苷[2-3]，主要包括：飛燕草型、天竺葵型、矢車(chē)菊型、芍藥型、牽?；ㄐ秃湾\葵型6種基本分子結(jié)構(gòu)[4]，其廣泛存在于植物的果實(shí)、葉片和花瓣中，使植物呈現(xiàn)不同顏色[5]。此外，花青素還具有較強(qiáng)的自由基清除能力[6]、抗氧化能力以及刺激抗氧化酶合成能力等[7]。

茄子，茄科植物，中國(guó)各地均有栽種，是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蔬菜之一[8]，也是提取花青素的重要原材料，主要含有飛燕草型花青素[9]。因花青素的抗氧化活性與其分子結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上所連羥基的總數(shù)有關(guān)[10]，所以相比于其它5種花青素，飛燕草型花青素分子上的羥基數(shù)量要多出1個(gè)～2個(gè)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[11-12]，是一種更強(qiáng)有力的抗氧化劑。而相比于其它植物中含有的花青素，茄子皮中所含的花青素具有更好的穩(wěn)定性[13]。

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展和生活水平的逐漸提高，人們對(duì)自身的健康也越來(lái)越重視[14]，對(duì)于花青素提取工藝的研究也越來(lái)越受到人們的關(guān)注[15]。對(duì)于提取劑的研究，如蔣召雪等[16]以茄子皮為原料，對(duì)比蒸餾水、乙醇、丙酮3種提取劑對(duì)花青素提取效果的影響，得出乙醇為最佳的提取劑。李玲等[17]同樣以茄子皮為原料，研究了不同濃度乙醇提取劑對(duì)花青素提取效果的影響，確定最佳提取劑為70%乙醇溶液。對(duì)于樹(shù)脂純化效果的研究，郭菲[18]以紫茄皮為原料，通過(guò)進(jìn)行靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)，篩選出AB-8型樹(shù)脂為最佳吸附樹(shù)脂。蔣曉嵐等[19]以紫色茄子皮為原料，鹽酸和乙醇混合溶液為提取劑，使用AB-8型樹(shù)脂及C18層析柱進(jìn)行純化，得到了較純的飛燕草型花青素單體。

此外，提取花青素的方法有很多，常用的有機(jī)溶劑提取法、微波輔助與超聲波輔助提取法等[20]，以及溶劑分離、層析和離子沉淀等純化方法[21]。其中采用乙醇溶液浸泡為最常用的粗提取方法[22]。大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)因具有選擇性高、易于預(yù)處理與回收等優(yōu)點(diǎn)[23]，已廣泛應(yīng)用于分離和純化等領(lǐng)域[24]，是純化花青素的主要方法[21]。在花青素提取、純化領(lǐng)域中，常用的吸附樹(shù)脂有AB-8、D101、X-5、S-8、001 ×7、D113、DM130、ADS-17等。其中關(guān)于純化茄子皮花青素的研究中，大多使用的是AB-8、D101等樹(shù)脂，而對(duì)于D113、ADS-17型樹(shù)脂從未報(bào)道使用。對(duì)于從植物中提取花青素的研究報(bào)道，所涉及的花青素大多為矢車(chē)菊型花青素，而對(duì)于提取飛燕草型花青素的報(bào)道較少。本試驗(yàn)使用乙醇溶液從茄子皮中提取花青素并用樹(shù)脂吸附法進(jìn)行純化，以探討提取劑乙醇濃度及6種樹(shù)脂（AB-8、D101、001×7、D113、DM130、ADS-17） 對(duì)花青素提取率及純化效果的影響，以期為從茄子皮中提取花青素提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茄子：哈爾濱地區(qū)市售，取茄子皮于冰箱中-18℃冷凍保存；無(wú)水乙醇（分析純）、飛燕草型花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度97.8%）：上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；AB-8、ADS-17、D101、D113、DM130、001×7（凝膠型）樹(shù)脂：天津市津達(dá)正通環(huán)保科技有限公司。6種樹(shù)脂的理化性質(zhì)如表1所示。

表1 6種樹(shù)脂的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of six resins

1.2 儀器與設(shè)備

721G可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SQP124電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CR21N高速冷凍型離心機(jī)：日立工機(jī)株式會(huì)社；恒溫加熱板、空層析柱：艷濤玻璃儀器經(jīng)銷(xiāo)部。

1.3 方法

1.3.1 花青素粗溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取剪碎的茄子皮樣品，每份200 g分別置于燒杯中，4種不同濃度的乙醇溶液各1 L為提取劑，濃度分別為50%、60%、70%、80%。將提取劑倒入裝有茄子皮的燒杯中，將燒杯放于加熱板上，恒溫60℃浸泡90 min。冷卻至室溫25℃后過(guò)濾，將濾液放于轉(zhuǎn)速為9 000 r/min的高速冷凍型離心機(jī)中離心5 min。離心后所得上清液即為花青素粗溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 花青素粗溶液的純化

6種樹(shù)脂各取100 g分別放于燒杯中，倒入無(wú)水乙醇溶液使其浸沒(méi)樹(shù)脂，浸泡2 h。采用濕法裝柱，1種類(lèi)型的樹(shù)脂需4根空層析柱，每根層析柱需樹(shù)脂100 g，取6種樹(shù)脂分別灌入空層析柱中。以樹(shù)脂體積3倍的去離子水沖洗各填裝樹(shù)脂后的層析柱并確保流出液中不含乙醇。取上述所得花青素粗溶液100 mL分別以2.5 mL/s的流速通過(guò)6種樹(shù)脂層析柱，依次收集流出液，避光保存待測(cè)定。

1.3.3 流出液中花青素的類(lèi)型及含量分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg飛燕草型花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶液溶解于50 mL容量瓶中并定容至刻度線，即為20 mg/L飛燕草型花青素標(biāo)樣。用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在338 nm～700 nm的絕對(duì)吸光度，找到飛燕草型花青素的最大吸收波長(zhǎng)。其中，絕對(duì)吸光度為待測(cè)溶液的吸光度值減去單獨(dú)測(cè)試空比色皿的吸光度值。

在338 nm～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，使用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定由最佳純化條件所得到的流出液。將測(cè)定結(jié)果與飛燕草型花青素標(biāo)樣進(jìn)行對(duì)比，從而判斷流出液中所含花青素的類(lèi)型及含量。采用如下公式計(jì)算流出液中所含花青素的濃度C。

式中：CS為飛燕草型花青素標(biāo)樣濃度，mg/L；AE為流出液在標(biāo)樣特征峰處的絕對(duì)吸光度；AS為標(biāo)樣在特征峰處的絕對(duì)吸光度。

為了表示流出液中所含目標(biāo)花青素的相對(duì)純度，定義流出液中花青素主要特征吸收峰處絕對(duì)吸光度與其主要雜質(zhì)吸收峰處絕對(duì)吸光度的比值為相對(duì)值R，其計(jì)算公式如下。

式中：AC為流出液中花青素主要特征吸收峰處絕對(duì)吸光度；AI為流出液中主要雜質(zhì)吸收峰處絕對(duì)吸光度。

花青素的提取率計(jì)算公式如下。

式中：P為花青素的提取率，mg/g；m為流出液中計(jì)算所得花青素質(zhì)量，mg；m0為原料茄子皮的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑濃度對(duì)花青素提取效果的影響

在338 nm～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別測(cè)量不同提取劑濃度的花青素粗溶液的絕對(duì)吸光度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 花青素粗溶液吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of anthocyanins in crude solutions

由圖1可看出，不同提取劑濃度所得的花青素粗溶液在420、530～550、580 nm及650 nm～660 nm處均有明顯的吸收峰，而飛燕草型花青素標(biāo)樣在波長(zhǎng)為530 nm～550 nm及580 nm處有相對(duì)較高的吸收峰，因此可判斷，飛燕草型花青素的特征吸收峰在波長(zhǎng)為530 nm～550 nm及580 nm處。其中，在飛燕草型花青素標(biāo)樣吸收曲線中，因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)為580 nm處的特征吸收峰對(duì)應(yīng)的絕對(duì)吸光度值較大，可確定在波長(zhǎng)為580 nm處的吸收峰為飛燕草型花青素的主要特征吸收峰。將不同濃度提取劑所得花青素粗溶液的吸收曲線與飛燕草型花青素標(biāo)樣的吸收曲線進(jìn)行對(duì)比，可以得出，在波長(zhǎng)420 nm及650 nm～660 nm處的吸收峰為雜質(zhì)吸收峰，而在各不同提取劑濃度所得的花青素粗溶液吸收曲線中，因?yàn)樵诓ㄩL(zhǎng)420 nm處的雜質(zhì)吸收峰對(duì)應(yīng)的絕對(duì)吸光度值均最大，所以可確定在波長(zhǎng)420 nm處的吸收峰為主要雜質(zhì)吸收峰。

圖2為在波長(zhǎng)530 nm～550 nm及580 nm處，不同濃度提取劑對(duì)花青素粗溶液絕對(duì)吸光度的影響。

圖2 提取劑濃度對(duì)花青素粗溶液在530 nm～550 nm及580 nm處絕對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of extractant concentrations on absolute absorbance of anthocyanins crude solutions at 530 nm-550 nm and 580 nm

由圖2可以看出，當(dāng)提取劑濃度分別為50%、70%、80%乙醇溶液時(shí)，花青素粗溶液在530 nm～550 nm及580 nm處的絕對(duì)吸光度較高，當(dāng)提取劑濃度為60%乙醇溶液時(shí)，花青素粗溶液在530 nm～550 nm及580 nm處的絕對(duì)吸光度較低。表2是由圖1及圖2中各花青素粗溶液在420 nm處主要雜質(zhì)吸收峰處的絕對(duì)吸光度與580 nm處飛燕草型花青素主要特征吸收峰處的絕對(duì)吸光度根據(jù)公式（2）計(jì)算得出。相對(duì)值R為花青素粗溶液中所含飛燕草型花青素相對(duì)于所含雜質(zhì)的比值，可表示不同的提取劑濃度對(duì)花青素粗溶液中飛燕草型花青素提取效果的影響。由表2的計(jì)算結(jié)果可知，當(dāng)提取劑為70%乙醇溶液時(shí)，相對(duì)值R最大，花青素粗溶液中含有的飛燕草型花青素相對(duì)純度較高。因此，對(duì)飛燕草型花青素提取效果最佳的提取劑為70%乙醇溶液。

表2 提取劑濃度與相對(duì)值RTable 2 Extractant concentrations and relative R

2.2 不同類(lèi)型樹(shù)脂對(duì)花青素純化效果的影響

將由不同濃度提取劑提取到的4份花青素粗溶液，分別通過(guò) DM130、ADS-17、D113、001×7、AB-8、D101型6種樹(shù)脂填裝的層析柱，其流出液的吸收光譜圖如圖3所示。

圖3 不同濃度提取劑的樹(shù)脂流出液吸收光譜圖Fig.3 Absorption spectrum of resins effluents with different concentrations of extractant

由圖3與圖1對(duì)比可知，對(duì)于4種濃度不同提取劑所得花青素粗溶液，D113型樹(shù)脂均可以明顯提高530 nm～550 nm及580 nm波長(zhǎng)處的絕對(duì)吸光度，并有效地降低420 nm及650 nm～660 nm波長(zhǎng)處的絕對(duì)吸光度，能夠有效地提高各流出液中所含飛燕草型花青素的純度。由圖3c中各流出液在420 nm主要雜質(zhì)吸收峰處的絕對(duì)吸光度與580 nm飛燕草型花青素主要特征吸收峰的絕對(duì)吸光度，根據(jù)公式（2）計(jì)算得出相對(duì)值R，結(jié)果見(jiàn)表3。相對(duì)值R為流出液中所含飛燕草型花青素相對(duì)于所含雜質(zhì)的含量，可表示6種樹(shù)脂對(duì)飛燕草型花青素純度的影響，最優(yōu)提取條件所得相對(duì)值R為0.89。由表3可看出，對(duì)飛燕草型花青素純化效果最佳的是D113型樹(shù)脂，純化效果最差的是DM130型樹(shù)脂。由具體數(shù)據(jù)可知，相比于70%乙醇溶液所提取到的花青素粗溶液，D113流出液中飛燕草型花青素的純度提高了48.3%。

表3 不同樹(shù)脂類(lèi)型純化效果Table 3 Purification effect of different resin types

圖4表示D113型、DM130型樹(shù)脂及提取劑濃度對(duì)飛燕草型花青素純化效果的影響。

圖4 D113和DM130樹(shù)脂及提取劑濃度對(duì)飛燕草型花青素純度的影響Fig.4 Effect of D113 and DM130 resins and extractant concentration on the purity of delphinidins

由圖4可見(jiàn)當(dāng)提取劑為70%乙醇溶液時(shí)，結(jié)合D113型樹(shù)脂從茄子皮中提取飛燕草型花青素，所得相對(duì)值R最大為1.32，可以有效地提高飛燕草型花青素的提取率及純度。D113型樹(shù)脂具有區(qū)別于另外5種樹(shù)脂的丙烯酸共聚交聯(lián)高分子基體上帶有羧酸基的樹(shù)脂結(jié)構(gòu)，且具有弱極性及最小的平均孔徑，對(duì)茄子皮中含有的飛燕草型花青素有很好的透過(guò)作用。將所得的最佳流出液和飛燕草型花青素標(biāo)樣溶液在338 nm～700 nm范圍內(nèi)測(cè)定絕對(duì)吸光度，結(jié)果如圖5所示。

圖5 D113型樹(shù)脂純化流出液與標(biāo)樣對(duì)比圖Fig.5 Comparison of D113 effluent with standard sample

由圖5可以看出，經(jīng)70%乙醇溶液提取及D113型樹(shù)脂純化所得的流出液與飛燕草型花青素標(biāo)樣在各吸收峰處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)均一致。因此，可確定本研究方法從茄子皮中提取到的花青素類(lèi)型為飛燕草型花青素，其提取率為1.83 mg/g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)使用乙醇溶液浸提與樹(shù)脂吸附法從茄子皮中提取花青素，經(jīng)過(guò)與飛燕草型花青素標(biāo)樣對(duì)比可知，所得花青素類(lèi)型為飛燕草型花青素。通過(guò)對(duì)比不同提取劑及樹(shù)脂對(duì)飛燕草型花青素純度的影響，確定最佳的提取條件是以70%乙醇溶液為提取劑浸泡提取與D113型樹(shù)脂吸附純化相結(jié)合，在此條件下從茄子皮中提取飛燕草型花青素的提取率為1.83 mg/g。本試驗(yàn)提供了一種從茄子皮中提取并純化飛燕草型花青素的新思路，以期為以綠色、便捷的試驗(yàn)方法從茄子皮中提取花青素提供一定的參考。