林 冰，王慧娟，王 瑩，沈燕君，齊美娜

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025;2.貴州省中藥(民族藥)創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽(yáng)550025;3.貴州大學(xué)中藥天然藥研發(fā)中心，貴州貴陽(yáng)550025)

山楂葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉［1］。山楂葉中含多種黃酮類化合物、有機(jī)酸類化合物、微量化合物和含氮化合物等［2］。山楂葉總黃酮(又稱益心酮，HLF)具有抗氧化、降血壓、降脂、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用［3］。山楂葉總黃酮在應(yīng)用及含量測(cè)定時(shí)多需要配制成乙醇溶液，本文考察了溫度、pH值、光照、空氣、氧化劑、還原劑以及金屬離子等因素對(duì)山楂葉總黃酮乙醇溶液穩(wěn)定性的影響，以期為合理開發(fā)和利用山楂葉總黃酮資源，以及為保證山楂葉總黃酮類化合物在加工貯藏中的穩(wěn)定性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 山楂葉總黃酮提取物(臨沂愛康藥業(yè)有限公司);無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、30%過(guò)氧化氫、氯化鉀、氯化鈉、三氯化鐵、氯化鈣、抗壞血酸等均為分析純;蒸餾水。

1.1.2 試驗(yàn)儀器FA1004電子分析天平(上海分析儀器總廠);HB－8數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司);751G型紫外可見分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠);WMK－02型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);臺(tái)式超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);PHS－3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 HLF供試溶液的制備HLF供試溶液在試驗(yàn)前配制。精確稱量山楂葉總黃酮提取物0.500 0 g，加適量50%乙醇，超聲溶解，過(guò)濾，濾液用50%乙醇定容至500 mL，得HLF供試溶液。

1.2.2 HLF供試溶液中總黃酮的含量測(cè)定 按照《中國(guó)藥典2010年版》［1］“山楂葉總黃酮含量測(cè)定”項(xiàng)下方法，精密量取供試溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，密塞，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3 溫度對(duì)HLF乙醇溶液的影響 分別精密量取供試溶液5 ml于7支試管中，密塞，分別在30、40、50、60、70、80、90℃水浴條件保溫30 min，取出冷卻至室溫后，照1.2.2項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)量吸光度值。

1.2.4 pH對(duì)HLF乙醇溶液的影響 分別精密量取供試溶液5 mL于12支試管中，再用HCl及NaOH調(diào)成pH值介于1～12之間的12份不同的樣品，密塞，避光放置15 min后，照1.2.2項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)量吸光度值。

1.2.5 氧化劑H2O2對(duì)HLF乙醇溶液的影響 用30%H2O2配制3%、6%、9%、12%的H2O2溶液，分別量取配制好的4種不同濃度的H2O2溶液1.7 mL于4個(gè)10 mL容量瓶中，用供試溶液定容，即得H2O2濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(2.0%為一般食品藥品中的最大安全使用量)［5］的供試溶液，另于第5個(gè)10 mL容量瓶中加入1.7 mL蒸餾水，用供試溶液定容。避光放置15 min后，照1.2.2項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)量吸光度值。

1.2.6 還原劑Na2SO3對(duì)HLF乙醇溶液的影響用Na2SO3配制濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的亞硫酸鈉溶液，分別量取配制好的5種不同濃度的Na2SO3溶液1.0 mL于5個(gè)10 mL容量瓶中，用供試溶液定容，即得Na2SO3濃度分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%(0.05%為一般食品藥品中的最大安全使用量)［5］的供試溶液，另于第6個(gè)10 mL容量瓶中加入1.0 mL蒸餾水，用供試溶液定容。避光放置15 min后，照1.2.2項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)量吸光度值。

1.2.7 自然光照和空氣對(duì)HLF乙醇溶液的影響分別精密量取供試溶液50 mL于3個(gè)100 mL燒杯中，其中1個(gè)燒杯用保鮮膜密封置于室內(nèi)暗處避光保存，1個(gè)燒杯用保鮮膜密封置于室內(nèi)自然光下保存，1個(gè)敞口置于室內(nèi)自然光下保存，分別在0、5、10、15、20、35、50 h取樣。照1.2.2.項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)量吸光度值。

1.2.8 金屬離子對(duì)HLF乙醇溶液的影響 分別用氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、三氯化鐵配制含Na+、K+、Ca2+和Fe3+離子各為1 mg/mL的溶液。分別精密量取供試溶液50 mL于5個(gè)100 mL燒杯中，分別向4個(gè)燒杯中精密加入2 mL含上述離子的溶液，第5個(gè)燒杯中加入2 mL蒸餾水，密封避光放置，分別于0、1、2、3、4、5 d取樣。照1.2.2項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)量吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)HLF乙醇溶液的影響

溫度對(duì)HLF乙醇溶液的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，HLF乙醇溶液吸光度值隨溫度的升高而變大，且當(dāng)溫度大于60℃以后，溶液吸光度的增加幅度明顯變大。類似的現(xiàn)象殷麗君等人亦有報(bào)道［4］，原因可能是加熱促使黃酮成分分解，產(chǎn)生了更多的酚羥基，因而吸光度明顯升高。

圖1 溫度對(duì)HLF乙醇溶液穩(wěn)定性的影響Fig.1 The effect of temperature on the stability of ethanol solution of howthorn leaf flavonoids

2.2 pH對(duì)HLF乙醇溶液的影響

pH對(duì)HLF乙醇溶液的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，pH值在2～11之間時(shí)，HLF乙醇溶液吸光度變化不大，較為穩(wěn)定。當(dāng)pH值大于11或者小于2時(shí)，吸光度隨pH變化較明顯。因此，HLF乙醇溶液在弱酸、弱堿及中性的環(huán)境時(shí)能夠保持在較為穩(wěn)定的狀態(tài)，在強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿環(huán)境時(shí)穩(wěn)定性較差。

圖2 pH值對(duì)HLF乙醇溶液穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effect of pH on the stability of ethanol solution of howthorn leaf flavonoids

2.3 氧化劑H2O2對(duì)HLF乙醇溶液的影響

氧化劑H2O2對(duì)HLF乙醇溶液的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，HLF乙醇溶液的吸光度隨著氧化劑H2O2濃度的增大而線性減小。因此，山楂葉總黃酮在生產(chǎn)、貯存及使用過(guò)程中應(yīng)注意避免與氧化劑接觸。

2.4 還原劑Na2SO3對(duì)HLF乙醇溶液的影響

還原劑Na2SO3對(duì)HLF乙醇溶液的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，HLF乙醇溶液的吸光度隨著還原劑Na2SO3濃度的增大而線性增加。因此，山楂葉總黃酮在生產(chǎn)、貯存及使用過(guò)程中應(yīng)注意避免與還原劑接觸。

圖3 氧化劑H2 O2對(duì)HLF乙醇溶液穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of H2 O2 on the stability of ethanol solution of howthorn leaf flavonoids

圖4 還原劑Na2 SO3對(duì)HLF乙醇溶液穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of Na2 SO3 on the stability of ethanol solution of howthorn leaf flavonoids

2.5 自然光照和空氣對(duì)HLF乙醇溶液的影響

自然光照和空氣對(duì)HLF乙醇溶液的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，密封避光條件下HLF乙醇溶液的穩(wěn)定性較好，自然光對(duì)HLF乙醇溶液的穩(wěn)定性有明顯影響，而在空氣與光照條件下，HLF乙醇溶液有較強(qiáng)的降解作用。

2.6 金屬離子對(duì)HLF乙醇溶液的影響

金屬離子對(duì)HLF乙醇溶液的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，Na+、K+和Ca2+離子對(duì)HLF乙醇溶液的穩(wěn)定性影響不大，F(xiàn)e3+具有使HLF乙醇溶液的吸光度數(shù)值增大的作用。類似的情況張久春等人亦曾經(jīng)觀察到過(guò)［6］。

圖5 自然光照和空氣對(duì)HLF乙醇溶液穩(wěn)定性的影響Fig.5 The effect of light and air on the stability of ethanol solution of howthorn leaf flavonoids

圖6 金屬離子對(duì)HLF乙醇溶液穩(wěn)定性的影響Fig.6 The effect of metal ions on the stability of ethanol solution of howthorn leaf flavonoids

3 結(jié)論

黃酮類化合物是一類穩(wěn)定性較差的化合物。本文對(duì)山楂葉總黃酮乙醇溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、氧化劑、還原劑、光照及空氣等因素均對(duì)其穩(wěn)定性有顯著的影響。因此，山楂葉總黃酮乙醇溶液在使用過(guò)程中應(yīng)盡量避免上述因素，長(zhǎng)期存放時(shí)應(yīng)置常溫密閉避光處保存。