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        刺梨籽油的脂肪酸組成和抗氧化活性研究*

        2013-10-23 11:58:48史亞男王道平游澤芳楊小生
        關(guān)鍵詞:刺梨籽油甲酯

        史亞男,王道平,馬 琳,游澤芳,楊小生*

        (1.貴州師范大學(xué)化學(xué)材料與科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng)550002;2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng)550002)

        刺梨(Rosa roxburghii Tratt)為薔薇科植物,其果實(shí)酸、澀、平,具有消食健脾、收斂止瀉、解暑等功效,用于治療痢疾、積食腹脹、腸炎、遺精和維生素C缺乏癥[1]。貴州、廣西等省區(qū)有豐富刺梨資源,人工和野生栽培產(chǎn)量均較大。近代藥理研究證明,刺梨具有防癌[2]、提高免疫和抑制腫瘤生長(zhǎng)[3]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[4]以及清除自由基、抗突變等作用[5]。刺梨的化學(xué)成分除了維生素類[6]和微量元素外,還含有黃酮成分、硬脂酸、B-谷甾醇[7]、三萜類化合物[8-11]。刺梨籽為刺梨的果實(shí)子粒,在刺梨產(chǎn)品的加工中,基本作為廢棄物丟棄,對(duì)此資源的有效利用,將對(duì)刺梨產(chǎn)業(yè)的循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的意義。已有研究報(bào)道刺梨籽中含有氨基酸、微量元素、脂肪酸[12]和小分子揮發(fā)性成分[13]等。本文對(duì)人工栽培刺梨果榨汁后刺梨籽油中總脂肪酸、結(jié)合型脂肪酸和游離型脂肪酸經(jīng)甲酯化后,進(jìn)行較為系統(tǒng)的分析測(cè)試,開展刺梨籽油的抗氧化活性研究,為刺梨籽油的深度開發(fā)利用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 材料與試劑 樣品采自貴州省龍里縣刺梨人工栽培基地(經(jīng)貴州大學(xué)安華明教授鑒定為Rosa roxburghii)。二苯代苦味基肼自由基(DPPH·)購(gòu)于百靈威公司;石油醚、二氯甲烷、甲醇、正己烷、氯化鈉、無水硫酸鎂、硫酸、無水乙醇、H2O2、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

        1.2.2 儀器與設(shè)備HP6890/HP5975C GC/MS聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司);HP-8453型紫外可見分光光度計(jì)(惠普公司);FA114型電子天平(上海??惦娮觾x器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮);恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);DZ-2A型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);粉碎機(jī)(浙江溫嶺市大鵬機(jī)械有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 刺梨籽油的提取 將100 g刺梨籽粉碎后連續(xù)回流提取。提取條件:溫度70℃,溶劑石油醚(沸程60~90℃),提取時(shí)間3 h(分兩次),料液比1∶15,得淡黃色澄清油狀液體6.6 g,提取率為6.6%。

        刺梨籽油結(jié)合型脂肪酸與游離型脂肪酸的制備[14]:取刺梨脂肪油500 mg,用5%的Na2CO3水溶液(100 mL)分散,同置于分液漏斗中振搖后,加入正己烷100 mL萃取,分離出正己烷層。正己烷層用水洗至中性,用無水MgSO4干燥,濾去Mg-SO4,回收正己烷,得到結(jié)合型脂肪酸(256 mg);水層先用2N HCl酸化,再用正己烷萃取,萃取層用水洗至中性,無水MgSO4干燥,濾去MgSO4,回收正己烷,即得到游離型脂肪酸(197 mg)。結(jié)合型脂肪酸與游離型脂肪酸的比例為1.3∶1。

        脂肪酸的甲酯化:(1)刺梨籽油總脂肪酸甲酯化[15]:取干燥后的刺梨籽油200 mg,加入4.3 mL H2SO4/甲醇溶液(2.5 mol/L),溶液置于反應(yīng)瓶中,70℃水浴條件下反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后加入正己烷萃取,取上清液進(jìn)行GC-MS分析;(2)游離型脂肪酸的甲酯化[15]:取干燥后的刺梨籽油游離型脂肪酸132 mg,加入3 mL H2SO4/甲醇溶液(2.5 mol/L),溶液置于反應(yīng)瓶中,70℃水浴條件下反應(yīng)30 min。加入5 mL正己烷振搖,取上清液進(jìn)行GC-MS分析;(3)結(jié)合型脂肪酸的甲酯化[16]:取干燥后的刺梨籽油結(jié)合型脂肪酸220 mg,加入5 mL KOH/甲醇溶液,在50℃水浴中振搖30 min,加入6 mL正己烷萃取,取上清液正己烷層進(jìn)行GC-MS分析。

        氣相色譜條件:色譜柱為HP-5MS 5%Phenyl Sloane(30 m×0.25 mm×0.25 m)彈性石英毛細(xì)管柱,柱溫45℃(保留時(shí)間2 min)。以3.5℃/min速度升溫至220℃,保持2 min。汽化室溫度250℃,載氣為高純He(99.999%),柱前壓7.62 psi,載氣流量1.0 mL/min,分流比20∶1。

        質(zhì)譜檢測(cè)條件:離子源為EI源;離子源溫度280℃;四級(jí)桿溫度150℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6μA;倍增器電壓1037 v;接口溫度280℃;質(zhì)量范圍30~50 amu。

        定性定量分析:通過HPMSD化學(xué)工作站,結(jié)合WILEY275和NIST2005質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù),并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)化合物人工圖譜解析[17-18],按峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算,求得各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

        1.2.3 刺梨籽油抗氧化活性研究DPPH·清除率的測(cè)定[19]:1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基和具有特征的紫紅色團(tuán)吸收峰,當(dāng)存在自由基清除劑時(shí),由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失,其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系,因而可用分光法進(jìn)行定量分析。

        稱取一定量的刺梨籽油,分別用無水乙醇配成濃度為2.5、5、10、20、40、60、80、100 mg/mL的待測(cè)溶液,吸取待測(cè)溶液2.0 mL,加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL,搖勻,放置30 min。以無水乙醇調(diào)零,測(cè)定517 nm處的吸光值A(chǔ)樣品。同時(shí),測(cè)定樣品溶液2.0 mL與無水乙醇2.0 mL混合液在517nm處的吸光度A對(duì)照,再測(cè)定2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇在517 nm處的吸光值A(chǔ)空白。同一測(cè)定重復(fù)3次。對(duì)DPPH自由基的清除率按下式計(jì)算:

        ·OH自由基清除率的測(cè)定[20-21]:測(cè)定方法采用Fenton反應(yīng)。參照YANG Xiao-ming等人的方法[21],并略作改進(jìn)。先配制0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液,取該液1 mL,加2 mL的0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4),充分混勻后加入0.75 mmo l/L硫酸亞鐵溶液(去離子水配制)1 mL,每加一管立即混勻,加入1 mL蒸餾水以補(bǔ)充體積,最后加入0.01%H2O21 mL為對(duì)照;反應(yīng)液在37℃ 保溫1 h,于536 nm處測(cè)定吸光度。依上法,加入0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1 mL,加入2 mL的0.2 mmo l/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4),充分混勻后,加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL,加入1 mL濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的樣品為處理樣;最后加入0.01%H2O21 mL??瞻讓?duì)照不加0.01%H2O2,以蒸餾水補(bǔ)充體積。每個(gè)質(zhì)量濃度樣品做3個(gè)平行樣品。對(duì)羥自由基的清除率按下式計(jì)算:

        2 結(jié)果與分析

        2.1 刺梨籽油脂肪酸成分

        等到玉玦嘯叫停息,它射出的光芒也達(dá)到了極盛,就是這樣的極盛,也只是億萬星河中的一粒,長(zhǎng)安上元夜萬千燈火中的一盞,黃梁村后池塘夏夜流螢中的一點(diǎn),夏日蓮花中的一瓣。只是我們的天地,又何曾忽視過一粒、一盞、一點(diǎn)與一瓣呢?少年們好像聽到由銀河里傳來的一聲嘆息,感到纖細(xì)星光微微的悸動(dòng),大榆樹輕輕震顫,積雪忽忽飄落,黃梁村像簸箕中的一粒黃豆上下跳動(dòng),跳動(dòng)的輕微,連村里最靈醒的狗子與公雞,都沒有感應(yīng)出來。

        總脂肪酸、結(jié)合型脂肪酸和游離型脂肪酸甲酯化成分氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果見表1。

        表1 刺梨籽油脂肪酸及含量Table 1 Components and contents of the methylated fatty acids from seed oil of R.Roxburghii

        由表1可知,刺梨籽油進(jìn)行甲酯化后,檢測(cè)鑒定了7種成分,占其色譜峰總面積的99.3%。其中,脂肪酸成分為6種,主要成分為亞油酸甲酯(48.35%)、亞麻酸甲酯(41.12%);刺梨籽油的游離型脂肪酸經(jīng)甲酯化后,檢測(cè)出了7種脂肪酸成分,亞油酸甲酯(34.08%)、亞麻酸甲酯(33.42%)也為主要成分;刺梨籽油的結(jié)合型脂肪酸經(jīng)甲酯化后,檢測(cè)出了脂肪酸成分8種,主要成分為亞油酸甲酯(30.37%)、9-十八碳烯酸甲酯(30.41%)。在結(jié)合型和游離型脂肪酸中均檢出了相對(duì)含量較高的棕櫚酸和硬脂酸或其他成分,與刺梨籽油中脂肪酸成分不一致,是否為由于在脂肪酸類型分型處理時(shí)成分被富集產(chǎn)生的結(jié)果,有待進(jìn)一步研究。

        亞麻酸具有較多的保健功能,如治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎、皮炎與牛皮癬以及哮喘、支氣管炎等病癥,可預(yù)防抑郁、精神分裂癥與阿爾茨海默病等精神病;對(duì)自身免疫系統(tǒng)疾病,癌變和抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,冠心病、卒中等心腦血管疾病和糖尿病等有預(yù)防作用[22]。亞油酸具有營(yíng)養(yǎng)腦細(xì)胞、調(diào)節(jié)植物神經(jīng)、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、降低冠心病發(fā)病率、提高免疫力等功效[23]。亞麻酸和亞油酸是人體必需的脂肪酸,在人體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ南┧幔瑢?duì)于合成磷脂,形成細(xì)胞結(jié)構(gòu),維持一切組織的正常功能,以及對(duì)于合成前列腺素,都是必要的[24]。

        刺梨籽油中含有豐富的以亞油酸和亞麻酸為代表的不飽和脂肪酸,可作為功能性油料來開發(fā)利用。

        2.2 刺梨籽油抗氧化活性研究

        2.2.1 DPPH清除率的測(cè)定 從圖1可知,隨著刺梨籽油濃度的增加,清除DPPH自由基的能力均呈上升趨勢(shì),當(dāng)刺梨籽油的溶液濃度為80 mg/mL時(shí),清除率為61.54%,為一拐點(diǎn)。清除率與刺梨籽油的濃度成量效關(guān)系。刺梨籽油具有強(qiáng)的DPPH自由基清除能力,這可能與刺梨籽油中含有大量的不飽和脂肪酸有關(guān)。

        2.2.2 羥基(OH)自由基清除率測(cè)定 采用Fenton反應(yīng),對(duì)刺梨籽油清除羥自由基能力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見圖2。從圖2可知,隨著刺梨籽油濃度的增加,清除羥基自由基的能力上升趨勢(shì)明顯,當(dāng)溶液濃度均有2 mg/mL時(shí),清除率為96.82%,顯現(xiàn)量效關(guān)系。

        圖1 刺梨籽油DPPH清除率Fig.1 Scavenging effects of R.Roxburghii seed oil on DPPH free radical

        圖2 刺梨籽油·OH自由基清除率Fig.2 Scavenging effects of R.Roxburghii seed oil on·OH radical

        在正常情況下,機(jī)體內(nèi)活性氧化物的產(chǎn)生和消除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡,由于各種原因,導(dǎo)致活性氧化物增多,和/或機(jī)體清除活性氧化物能力下降,機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),體內(nèi)組織細(xì)胞活性氧化物含量相對(duì)增加,對(duì)機(jī)體造成傷害??寡趸瘎┗蜃杂苫宄飳?duì)細(xì)胞氧化損傷能較好地保護(hù)。本文發(fā)現(xiàn)刺梨籽油具有清除羥基自由基、DPPH自由基的能力,抗氧化活性效果顯著。

        3 討論

        3.1 對(duì)刺梨籽油進(jìn)行甲酯化,并檢測(cè)鑒定了7種成分,明確了脂肪酸成分為6種,主要成分為不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸。刺梨籽油中的脂肪酸,無論是結(jié)合型還是游離型脂肪酸,均以亞油酸為代表的不飽和脂肪酸為主;刺梨籽油能有效清除羥基自由基、DPPH自由基,且對(duì)前者效果更佳,抗氧化活性顯著,當(dāng)刺梨籽油的濃度為2 mg/mL時(shí),對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)96.82%。因此,刺梨籽油可作為一種富含不飽和脂肪酸的功能性食用油脂來深度開發(fā)利用。

        3.2 本文涉及的刺梨總脂肪油中的脂肪酸組分比朱海燕[14]等報(bào)道的脂肪酸成分少且主要成分油酸未檢測(cè)到,可能與提取處理方法等有關(guān),需要進(jìn)一步探討。

        3.3 刺梨籽油脂的游離脂肪酸、結(jié)合脂肪酸中Hexadecanoic acid methyl ester含量較高,但在總油脂中未檢測(cè)到,是否與脂肪酸的甲酯化處理后富集有關(guān),有待進(jìn)一步探究。把刺梨籽的總脂肪油用堿處理分成結(jié)合型脂肪酸和游離型脂肪酸,并對(duì)它們進(jìn)行分析,有利于脂肪酸油的比較研究。對(duì)于甲酯化處理方法的條件優(yōu)化,有待深入研究。

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