齊芬芳 張金霞 牛熙

摘要：本研究從受毒死蜱污染的農(nóng)田中取樣，分離得到一株毒死蜱高效降解菌株，該菌株最高能夠耐受1000mg·L^-1濃度的毒死蜱，72h對濃度100mg·L^-1毒死蜱的降解率為52.34%。通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子學(xué)方法對該菌株進(jìn)行鑒定，確定為枯草芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：毒死蜱;降解菌;分離;鑒定

自有機(jī)氯農(nóng)藥在我國限用之后，有機(jī)磷農(nóng)藥（organo-phosphorus pesticides，OPs）就成為生產(chǎn)及推廣使用最多的一種農(nóng)藥，該農(nóng)藥在環(huán)境中降解快、殘毒低，而且具有成本低、藥效高、種類多、藥害小、選擇性高、治理范圍廣、比有機(jī)氯農(nóng)藥容易降解等優(yōu)點。但有機(jī)磷農(nóng)藥在土壤、水體、植物和動物體內(nèi)殘留，可隨著食物鏈的富集進(jìn)入人體，從而影響人類健康。研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解對于保護(hù)環(huán)境、促進(jìn)人們健康具有重要意義。

1971年，首次有研究表明，微生物可降解OPs，由于殺蟲劑二嗪農(nóng)的生物降解，有害病蟲褐飛虱的控制效率有所下降。繼而研究者通過富集、馴化、分離的純培養(yǎng)方法，篩選出多種能夠降解OPs的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類等，并對農(nóng)藥的降解途徑以及代謝方式進(jìn)行了研究。目前，農(nóng)藥的微生物降解是指利用微生物的代謝過程使農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其由有害的大分子化合物降解為無害的小分子化合物，直至CO₂、H₂O，實現(xiàn)無害化降解的過程，具有降解速度快、降解效果徹底、環(huán)境影響小、處理成本低等特點。微生物降解作為一種高效清除農(nóng)藥污染環(huán)境生物技術(shù)和目前降解OPs的主要手段，已成為OPs降解的研究熱點。

本研究以毒死蜱作為目標(biāo)降解物，從自然環(huán)境中分離篩選高效降解菌株，為有機(jī)磷農(nóng)藥微生物降解的進(jìn)一步研究提供菌種資源和理論依據(jù)。

一、材料與方法

（一）土壤樣品

土壤樣品采集于貴陽市某農(nóng)田。采樣深度為510cm。

（二）主要培養(yǎng)基及試劑

1、培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g·L^-1;NaCl10g·L^-1;酵母粉5g·L^-1;H₂O1000mL（pH7.0）。如為固體平板則加入1.5%的瓊脂。將藥品倒入燒杯中，用玻璃棒攪拌使其完全溶解，用1mol·L^-1的NaOH調(diào)節(jié)pH值在7.0，再分裝至250mL三角瓶中，至高壓滅菌鍋中滅菌后使用。

毒死蜱無機(jī)鹽培養(yǎng)基：K₂HPO₄1.5g·L^-1;KH₂PO₄0.5g·L^-1;（NH₄）₂SO₄1.0g·L^-1;NaCl 1.0g·L^-1;Mg-SO₄.7H₂O 0.05g·L^-1;H₂O 1000mL（pH7.0）。農(nóng)藥按需添加，如為固體平板培養(yǎng)基則加入1.5%的瓊脂。配置好后121℃滅菌20min備用。

2、主要試劑。毒死蜱原藥購自特安源生物科技公司;40%毒死蜱購自浙江東風(fēng)化工有限公司;無水乙醇、二甲苯、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸、石油醚、過氧化氫、氫氧化鈉、肌酸等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。瓊脂糖凝膠回收試劑盒由天根生化科技（北京有限公司）生產(chǎn);引物由賽默飛世爾科技公司合成。

（三）菌株的富集與初篩

稱取土樣3g于毒死蜱無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在37℃搖床120r·min^-1培養(yǎng)5d，再以10%接種量轉(zhuǎn)入新鮮的毒死蜱無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中毒死蜱濃度（mg·L^-1）為0、50、100、200。將最后一次培養(yǎng)液取樣進(jìn)行梯度稀釋，涂布于毒死蜱無機(jī)鹽瓊脂平板，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出單菌落時，挑取同批相比較大單菌落于添加50mg·L^-1毒死蜱的LB普通瓊脂平板上連續(xù)劃線5次純化菌落，直到菌落表面顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征完全一致，顯微鏡下進(jìn)一步確定純種，對所得降解菌株進(jìn)行保種。將純化菌株接種于100mg·L^-1的毒死蜱無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，梯度增加毒死蜱濃度至1000mg·L^-1，篩選高效降解菌株。

（四）高效降解菌株的篩選

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定。根據(jù)毒死蜱在波長為292nm時有紫外特殊吸收峰的特性，通過分光光度法來確定在波長為292nm時樣品的吸光值。以石油醚為溶劑，配制1000mg·L^-1的毒死蜱母液。再根據(jù)需要稀釋成濃度（mg·L^-1）為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200的待測溶液。以石油醚為空白對照，采用紫外分光光度計在波長為292nm時測定吸光值，記錄毒死蜱濃度和對應(yīng)的吸光值，重復(fù)三次。然后以毒死蜱濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制毒死蜱的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程和R²。

2、降解菌種子培養(yǎng)液的制備。在LB液體培養(yǎng)基中富集篩選出的高耐藥性菌株，當(dāng)菌液達(dá)到對數(shù)增長期時，吸取1.5mL培養(yǎng)液至離心管中，以10000r·min^-1離心1min收集菌體，用0.9% NaCl洗滌，分別懸浮于無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中。

3、降解菌降解率測定。將毒死蜱母液稀釋成100mg·L^-1，過濾除菌，加入到100mL滅菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。以10%的接種量將種子液加入到100mg·L^-1毒死蜱無機(jī)鹽培養(yǎng)基中37℃120r·min^-1培養(yǎng)3d，以未加菌的毒死蜱無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為空白對照，培養(yǎng)好的菌液為待測樣品。每處理重復(fù)三次。取待測液體培養(yǎng)基50mL，加石油醚50mL，振蕩4min，靜置分層;重復(fù)提取兩次，合并兩次提取液后吸取上清液用紫外分光光度計測取其OD292值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出培養(yǎng)液中毒死蜱的質(zhì)量濃度，計算毒死蜱的降解率，以確定高效降解菌。降解效率公式為：

（五）高效降解菌株的鑒定

1、形態(tài)學(xué)鑒定。將菌株劃線于LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡下觀察菌體。

2、生理生化鑒定。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》的方法，對篩選得到的高效降解菌進(jìn)行生理生化試驗鑒定，包括葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、山梨醇發(fā)酵、淀粉水解明膠液化、MR、過氧化氫酶、V-P、檸檬酸鹽利用、接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原和吲哚試驗。

3、分子鑒定。試劑盒提取目的菌株總DNA，16SrDNA特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：P16SL：5'-GAGA-GTTTGATCCTGGCTCAG-3';P16SR：5'-GCCCCCGT-CAATTCCTTTGAG-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s，54℃退火40s，72℃延伸50s，30個循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物切膠測序。

測序后的16SrDNA序列在NCBI中Blast比對同源性。選擇同源關(guān)系較近的序列，采用MEGA7進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

二、結(jié)果與分析

（一）高效降解菌的分離

以毒死蜱為唯一碳源，從受污染的農(nóng)田土壤樣品中篩選出57株降解毒死蜱的菌株。純化后梯度增加毒死蜱濃度至1000mg·L^-1，分離到1株具有高耐藥性的降解菌株，編號為B19。

（二）降解效率的測定

采用紫外分光光度法測定標(biāo)準(zhǔn)濃度毒死蜱，以毒死蜱濃度為橫坐標(biāo)（x），毒死蜱在292nm的吸光值為縱坐標(biāo)（y），繪制毒死蜱的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得線性回歸方程為：y=0.0154x+0.0579，R²=0.9991，結(jié)果顯示在0～200mg·L^-1毒死蜱濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，此線性方程可以用來計算樣品中毒死蜱的濃度。

將篩選出的高效降解菌株種子液以10%的接種量接種于100mg·L^-1的毒死蜱無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，在37℃、120r·min^-1培養(yǎng)72h，利用石油醚萃取后用紫外分光光度計測量OD292，以計算降解率。菌株B19在100mg·L^-1毒死蜱中培養(yǎng)72h對毒死蜱的降解效率為52.34%。

（三）菌株的鑒定

1、菌株的形態(tài)。通過形態(tài)學(xué)觀察，對菌株B19形態(tài)特征（見圖2a、圖2b）進(jìn)行描述，結(jié)果如下：菌落在LB培養(yǎng)基上為圓形或近圓形，呈皺褶狀，干燥（見圖2a）。制成裝片在顯微鏡下觀察為革蘭氏染色陽性菌，桿狀，末端圓（見圖2b）。

2、菌株的生理生化特征。對菌株B19進(jìn)行生理生化試驗，特征見表1。結(jié)合生理生化特征，將該菌初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3、分子學(xué)鑒定。

（1） PCR擴(kuò)增。提取菌株B19的基因組DNA作為模板，以16SrDNA的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，120v電壓電泳40min，出現(xiàn)900bp左右的條帶，切膠測序見圖3。

（2）測序結(jié)果分析。將菌株B19的16S rDNA核苷酸序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對，結(jié)果表明，菌株B19與枯草芽孢桿菌的同源性高達(dá)99%，說明該菌株在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上屬于枯草芽孢桿菌，學(xué)名為Bacillus subtilis。對該序列用MEGA7軟件中的鄰接法進(jìn)行聚類分析（見圖4），可以看出其與枯草芽孢桿菌同源性最高，歸為同一支。綜合形態(tài)學(xué)及生理生化特征分析，將菌株B19鑒定為枯草芽孢桿菌。

三、結(jié)論與討論

毒死蜱作為我國有機(jī)磷農(nóng)藥中廣泛使用的農(nóng)藥之一，其殘留問題已引起農(nóng)藥界的極大關(guān)注。李文華從蘋果園中分離到三株對毒死蜱具有高效降解能力的降解細(xì)菌HP-1、HP-2和HP-3，將其分別鑒定為人蒼白桿菌，硝基還原假單胞菌：微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌。在pH7.2和28℃條件下培養(yǎng)7d，細(xì)菌HP-1、HP-2和HP-3對100mg·L^-1的毒死蜱降解率分別可以達(dá)到50.6%、59.5%和45.6%。張群等測定了一株從污染淤泥中分離的高效降解菌寡氧單孢菌對100mg·L^-1毒死蜱4d的降解效率約為60%。

本研究從常年施用毒死蜱農(nóng)藥的農(nóng)田土壤中篩選出1株能以毒死蜱為唯一碳源和能源的高效降解菌B19，該菌株最高能夠耐受1000mg·L^-1濃度的毒死蜱，對濃度100mg·L^-1毒死蜱72h的降解率為52.34%。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化、16SrDNA序列同源性以及聚類分析，將該菌鑒定為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌作為一種極具研究開發(fā)潛力的微生物菌種，具有安全、高效、環(huán)保的特點，在環(huán)境污染處理中占據(jù)著重要地位。范迪等研究發(fā)現(xiàn)：添加枯草芽孢桿菌和光合細(xì)菌能夠顯著凈化水禽養(yǎng)殖水質(zhì)，有效改善養(yǎng)殖環(huán)境。何芝菲從果園土壤中分離到1株枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），對100mg·L^-1氯氰菊酯120h降解率為30.25%，對氯氰菊酯有明顯的降解作用。

本研究篩選出的對有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效降解能力菌株枯草芽孢桿菌B19，來源于土壤，能夠適應(yīng)土壤環(huán)境，可作為有機(jī)磷農(nóng)藥微生物降解的優(yōu)良菌株材料進(jìn)行下一步研究。

作者簡介：齊芬芳（1986-），女，湖南株洲市人，碩士，講師，研究方向：有機(jī)磷農(nóng)藥微生物降解。

（責(zé)任編輯 曹雯梅）