李琳+萬忠海++文學(xué)忠

摘 要：建立諾氟沙星（ Enrofloxacin，NOR）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIF）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、雙氟沙星（Difloxacin ，DIF）、培氟沙星（Pefloxacin，pef）和氟羅沙星（Fleroxacin，F(xiàn)LX，）8種氟喹諾酮類藥物人工抗原的合成及鑒定方法。采用碳二亞胺（EDC）法將8種氟喹諾酮類藥物與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，用于制備免疫抗原與包被抗原，通過紫外掃描和SDS-PAGE 對人工抗原進(jìn)行鑒定，免疫原免疫Balb/c 小鼠，獲得抗體。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用間接ELISA方法檢測小鼠血清抗體效價(jià)均達(dá)到1：8000以上。為進(jìn)一步制備抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體提供了良好的免疫原。

關(guān)鍵詞：氟喹諾酮；人工抗原；合成；鑒定

中圖分類號：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160832005

氟喹諾酮藥物（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs），又名6-氟喹諾酮類，是第3代喹諾酮類抗菌藥。相比第1代和第2代喹諾酮類藥物（quinolones，QNs）具有抗菌譜更廣、抗菌作用更強(qiáng)、副作用低和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，故在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中很快取得廣泛應(yīng)用。FQs是小分子化合物，屬于半抗原，將其與蛋白質(zhì)載體進(jìn)行偶聯(lián)后，再制備成完全抗原，即指小分子物質(zhì)必須和載體蛋白偶聯(lián)之后方能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體，并包被于固相載體上用于ELISA檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

諾氟沙星（99.6%）、環(huán)丙沙星（99.7%）、恩諾沙星（100%）、沙拉沙星（99.6%）、氧氟沙星（99.0%）、雙氟沙星（100%）、培氟沙星（98%）和氟羅沙星（99.1%）購買于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、碳二亞胺（EDC）、卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購買于Sigma-Aldrich公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純購于鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器

BECKMAN DU-640核酸蛋白分析儀（USA）；自動凝膠成像儀（美國伯騰）； SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海壘固）；超純水儀（ELGA）； CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（力康HF90型氣套式）； -80℃冰柜（日本三洋）；TECAN酶聯(lián)免疫檢測儀（AUSTRIA）。

1.1.3 試驗(yàn)動物和細(xì)胞

雌性，8周齡，體重14～16g BALB/c 小鼠購于長春市生物制品所；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 完全抗原的制備采用碳二亞胺法

8種氟喹諾酮藥物完全抗原制備方法步驟基本相同，但秤取的量不盡相同，詳見試劑質(zhì)量配比表。實(shí)驗(yàn)步驟如下：準(zhǔn)確稱取N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）A mg，碳二亞胺（EDC）B mg，氟喹諾酮藥物 C mg，加入 D μL 的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）此溶液命名為Ⅰ，并放置在室溫下遮光攪拌孵育24h；準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白（BSA）E mg， 加入0.01 mol/L（pH 值7.4）磷酸鹽緩沖液（PBS）F mL，此溶液命名為Ⅱ。將孵育好的溶液Ⅰ逐滴加入到Ⅱ，同時(shí)攪拌，室溫下攪拌3h。 反應(yīng)結(jié)束，用0.01 mol/L（pH 值7.4）PBS 透析，透析后溶液定容至3 mL，零下20℃分裝保存。合成包被抗原方法同上。

1.2.2 試劑質(zhì)量配比表

1.2.3 偶聯(lián)產(chǎn)物分析及分子結(jié)合比測定

采用聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分析和紫外分光光度法測定半抗原與載體蛋白的分子結(jié)合比方法測定。

1.2.4 完全抗原的鑒定

采用SDS-PAGE 凝膠電泳鑒定和紫外掃描鑒定。

1.2.5 雌性56日齡BALB/c小鼠（體重14～16g），分成3批次進(jìn)行免疫（4只/批）

混合完全抗原與等量福氏完全佐劑乳化完全后作為首次免疫用，以劑量為200?g/只注射腹腔。第2次免疫在28d后進(jìn)行，加強(qiáng)免疫時(shí)間間隔為14d1次，換用福氏不完全佐劑，其余同前。小鼠斷尾采血在第3次免疫后進(jìn)行，檢測血清效價(jià)采用間接ELISA方法，待血清效價(jià)達(dá)到1：8000以上。融合前3d，不加佐劑，進(jìn)行強(qiáng)化免疫。

1.2.6 小鼠血清效價(jià)測定及檢測方法

小鼠尾部采血0.1mL，5000r/min離心5min，收集血清，采用間接ELISA方法檢測血清效價(jià)，并設(shè)陰性和空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種氟喹諾酮類藥物

與BSA的偶聯(lián)產(chǎn)物BSA-X（8種氟喹諾酮類藥物）聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分析及其與OVA的偶聯(lián)產(chǎn)物OVA-X聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分析結(jié)果可以看出：偶聯(lián)物的電泳條帶與載體蛋白均不相同，證實(shí)已經(jīng)成功偶聯(lián)。

2.2 紫外分光光度法測定半抗原與載體蛋白的分子結(jié)合比

將每種溶液稀釋至200?g/mL（偶聯(lián)產(chǎn)物按蛋白計(jì)），經(jīng)過紫外掃描獲得每種溶液的紫外吸收光譜，并發(fā)現(xiàn)BSA、X、BSA- X3者的紫外吸收光譜差異明顯（OVA及其處理對照類同），可以說明偶聯(lián)成功。而經(jīng)測定各溶液的吸光值，代入公式計(jì)算X與BSA和OVA的分子結(jié)合比分別為2：1和3：1不等。

2.3 免疫小鼠血清抗體效價(jià)

8周齡BALB/c雌鼠進(jìn)行首免，三免10d后應(yīng)用間接ELISA法檢測小鼠血清效價(jià)通過實(shí)驗(yàn)獲得小鼠均已經(jīng)產(chǎn)生了特異性抗體。

2.4 篩選方法的可行性分析

分別把BSA、OVA、BSA-X（8種氟喹諾酮類藥物）和OVA-X 5μg/ml包被過夜，每孔100μl。陰性血清1：400倍稀釋，陽性血清1：4000倍稀釋，并設(shè)置空白對照。顯示結(jié)果為OVA與陽性血清反應(yīng)的OD值在0.1左右，表明與OVA發(fā)生特異性反應(yīng)。而陽性血清與BSA-X反應(yīng)的OD值比與BSA反應(yīng)的OD值要高，這樣陽性血清中不僅產(chǎn)生了針對BSA的抗體還產(chǎn)生了針對8種氟喹諾酮類藥物的抗體。因此采用OVA-X作為包被抗原是必須且可行的。

3 小結(jié)

3.1 氟喹諾酮類藥物

是獸醫(yī)臨床常用的一種獸藥，近年來使用量較大。由于其具有潛在致癌的危害性，故而一旦在畜禽產(chǎn)品中殘留量過高，人類長期使用便會危及健康。同時(shí)對畜牧業(yè)發(fā)展也會產(chǎn)生重要的影響，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

3.2 本試驗(yàn)

將8種氟喹諾酮類藥物與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)制備人工抗原，該試驗(yàn)結(jié)果奠定了8種氟喹諾酮類藥物ELISA檢測試劑盒組裝的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]賈國超，職愛民，李夢琴，等.氟羅沙星殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒的研制[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（11）：2251-2261.

[2]劉儒彪，胡驍飛，孫亞寧，等.沙拉沙星完全抗原的合成及多克隆血清制備[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（5）：167-171.

[3]范國英，劉俊偉，鐘華，等.培氟沙星人工抗原的合成與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（11）：2278-2279.

[4]楊先樂，黃宜運(yùn)，胡鯤，等.環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備及鑒定[J].食品科學(xué)，2010，31（12）：16-20.

[5]劉慶棠，職愛民，李青梅，等.諾氟沙星單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32（9）：716-720.

[6]于海峰，張森，萬忠海，等.氧氟沙星完全抗原的合成鑒定及其單克隆抗體的制備純化[J].食品科學(xué)，2006，27（10）：223-228.