□ 謝靜玲 靖邊縣食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

1 材料方法

1.1 檢測(cè)樣品

檢測(cè)對(duì)象是3個(gè)冷凍干燥樣品，分別是PTA菌落總數(shù)、沙門氏菌PTB—1，沙門氏菌PTB—2[1]。分別在樣品中加入10 mL生理鹽水，混合均勻即為待測(cè)原液。培養(yǎng)基包括平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基等；細(xì)菌微量鑒定管包括賴氨酸生化管、氰化鉀對(duì)照管、蛋白胨水等；腸炎沙門氏菌陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株，由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保管中心提供；革蘭氏陰性菌鑒定卡，來(lái)源于法國(guó)梅里埃公司；沙門氏菌診斷血清，來(lái)源于天潤(rùn)藥物公司。

1.2 儀器設(shè)備

檢測(cè)儀器包括生物安全柜、細(xì)菌鑒定儀、生化培養(yǎng)箱、全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)等。

1.3 PTA菌落數(shù)計(jì)數(shù)方法

在PTA菌落總數(shù)原液中，取1 mL菌液加入9 mL生理鹽水，均勻混合制成1×10—1稀釋液；經(jīng)梯度稀釋制成1×10～1×10—67個(gè)稀釋樣品。使用無(wú)菌吸管，從每個(gè)稀釋液中取出1 mL，置于無(wú)菌平皿中，并吸取1 mL空白稀釋液作為對(duì)照。每個(gè)平皿傾注15～20 mL的PCA，冷卻處理后，在凝固瓊脂表面覆蓋一層薄PCA，防止彌漫菌落生長(zhǎng)。瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，在36 ℃條件下培養(yǎng)48 h，取出后計(jì)數(shù)。

1.4 沙門氏菌鑒定方法

按照指導(dǎo)書將10 mL樣品原液轉(zhuǎn)到225 mL的BPM增菌液上，并進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，在36 ℃條件下培養(yǎng)18 h。取1 mL前增菌培養(yǎng)物，在10 mLTTB內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)種，在42 ℃條件下培養(yǎng)18 h；另取1 mL前增菌培養(yǎng)物在10 mL SC內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)種，在36 ℃條件下培養(yǎng)18 h。分離時(shí)，使用接種環(huán)取TTB、SC增菌液各一環(huán)，接種在BS、HE瓊脂、XLD瓊脂以及沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，在36 ℃條件下培養(yǎng)18 h。

2 結(jié)果分析

2.1 PTA菌落數(shù)

選擇菌落數(shù)在350～700 CFU/mL的10—1稀釋度平板4個(gè)，計(jì)算平均值作為菌落總數(shù)，結(jié)果顯示為580 CFU/mL。檢測(cè)操作時(shí)，使用的平板計(jì)數(shù)瓊脂來(lái)源于2個(gè)廠家，每個(gè)稀釋度做4個(gè)平板，可在菌體濃度未知時(shí)，防止漏檢現(xiàn)象，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2]。取4個(gè)培養(yǎng)基的平均值，即580 CFU/mL，得到比分值（Z）為0.8，滿足|Z|≤2的要求，是滿意的結(jié)果。

2.2 沙門氏菌

2.2.1 培養(yǎng)結(jié)果

PTB—1在HE上培養(yǎng)出粉紅色菌落，在BS平板上培養(yǎng)出灰黑色菌落，在XLD平板上培養(yǎng)出黃白色菌落。PTB—2在BS平板上培養(yǎng)出黑色菌落，在HE平板上培養(yǎng)出黑色菌落，在XLD平板上培養(yǎng)出黑色菌落。

2.2.2 生化試驗(yàn)

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“食品微生物檢驗(yàn)—沙門氏菌檢驗(yàn)”，開展生化試驗(yàn)，分離菌株的結(jié)果見(jiàn)表1，其中陽(yáng)性為“+”，陰性為“—”。分析可知，PTB—1初步鑒定為非沙門氏菌，PTB—2、陽(yáng)性對(duì)照組初步鑒定為沙門氏菌屬。

2.2.3 生化鑒定

在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，挑選至少3個(gè)典型的可疑菌落，接種TSI、NA，在36 ℃條件下培養(yǎng)18 h，利用全自動(dòng)微生物生化鑒定/藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。取 PTB—1、PTB—2、陽(yáng)性對(duì)照菌株，接種在TSA平板上，在37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，使用生理鹽水制成菌懸液，測(cè)定菌液濃度，并進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。結(jié)果顯示，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的報(bào)告中，PTB—2是沙門氏菌書的可能性為97%，鑒定等級(jí)是相當(dāng)好；PTB—1是腸桿菌，可能性為99%，鑒定等級(jí)是相當(dāng)好；陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株是沙門氏菌屬，可能性為98%，鑒定等級(jí)是相當(dāng)好。

表1 沙門氏均屬生化反應(yīng)初步鑒定表

2.2.4 血清學(xué)鑒定

取少量純培養(yǎng)被檢菌苔，使用沙門氏菌診斷血清進(jìn)行鑒定，開展玻片凝集試驗(yàn)，結(jié)果顯示完全符合。

2.2.5 鑒定報(bào)告

綜合生化鑒定、血清學(xué)鑒定結(jié)果，得出結(jié)論：樣品PTB—1沙門氏菌，未檢出；樣品PTB—2沙門氏菌，檢出。本次檢測(cè)結(jié)果和CNAS指定值是滿意的結(jié)果。

3 結(jié)語(yǔ)

本次檢測(cè)能力驗(yàn)證中，采用多種檢驗(yàn)方法，例如多平行樣本、多稀釋度樣品，保證了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)中心的結(jié)果，均和CNAS指定值符合，檢驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下：①PTA菌落數(shù)檢驗(yàn)中，使用不同廠家生產(chǎn)的PCA，且稀釋度樣品要均勻混合；平板計(jì)數(shù)瓊脂凝固后，再覆蓋一層薄瓊脂，能避免菌落蔓延；②沙門氏菌屬檢驗(yàn)中，要注意觀察不同平板上的菌落特征，避免漏檢；③同時(shí)使用顯色培養(yǎng)基、全自動(dòng)衛(wèi)生區(qū)生化鑒定/藥敏分析系統(tǒng)，能進(jìn)一步提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)本次驗(yàn)證，可增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)?zāi)芰透?jìng)爭(zhēng)力，不斷提升檢驗(yàn)技術(shù)水平。