□ 蔡樹(shù)杏 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院

王錦旭 韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

1 前言

牡蠣俗稱蠔或海蠣子，因肉質(zhì)鮮美可口而受到人們的喜愛(ài)，具有很高的藥用價(jià)值，并且含有豐富的蛋白質(zhì)和碳水化合物，因其鋅含量極高，富含鐵、鈣等元素。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，牡蠣多糖、多肽具有較高的生物活性，牡蠣多糖、多肽的提取方法有堿提取法、酸提取法、蛋白酶水解法等。堿提取法和酸提取法的條件較為劇烈，且無(wú)選擇性，所以近年來(lái)酶提取工藝得到較好發(fā)展。由單一酶解法，到多種酶復(fù)合酶解，再到多種酶分步酶解、酸酶結(jié)合酶解、多糖多肽聯(lián)產(chǎn)加工，其目的都是得到不同分子量的不同生物活性成分，或者降低生產(chǎn)成本，總之，酶解技術(shù)的發(fā)展為研究牡蠣活性成分、活性作用提供了一種高效的途徑。

2 酶解工藝

研究牡蠣酶解技術(shù)，一是為了獲得營(yíng)養(yǎng)更加豐富、味道更加鮮美的調(diào)味品。二是為了尋找具有生物活性作用的多糖或者多肽。酶解工藝條件包括酶的種類，添加的數(shù)量、順序，酶解時(shí)間等，不同的酶解技術(shù)得到的酶解產(chǎn)物不同，分子量和結(jié)構(gòu)都存在差異，酶解的程度也不一樣，所得產(chǎn)物的風(fēng)味和活性作用也存在差異。從酶解技術(shù)的發(fā)展來(lái)說(shuō)，復(fù)合酶解、多步酶解可以得到酶解程度更高、目標(biāo)分子量更為精準(zhǔn)、活性更高的產(chǎn)物。

2.1 單一酶酶解

王長(zhǎng)偉[1]等以新鮮無(wú)殼牡蠣為原料，采用胰酶酶解的方法制備牡蠣活性肽，經(jīng)膜分離后得到均分子量為750 Da的活性肽。趙榮濤[2]等利用化學(xué)方法分別評(píng)價(jià)9種酶對(duì)牡蠣蛋白酶解多肽的降血糖和抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解得到的多肽抗血糖升高作用較強(qiáng)，糜蛋白酶酶解得到的多肽抗氧化作用較強(qiáng)。張雪妍[3]等利用木瓜蛋白酶對(duì)牡蠣進(jìn)行酶解，得到質(zhì)量濃度為14.95 mg/mL的酶解液。徐慧[4]等利用納豆芽孢桿菌對(duì)牡蠣邊角料進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌可以用于牡蠣的發(fā)酵。許慶陵[5]等利用Alcalase堿性蛋白酶水解牡蠣，制備牡蠣水解蛋白，得到水解度為40.38%的牡蠣多肽。馮丹丹[6]等研究了4種蛋白酶對(duì)牡蠣的酶解作用，發(fā)現(xiàn)枯草桿菌中性蛋白酶的水解程度最高，其次為風(fēng)味蛋白酶，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的水解程度較低。

2.2 復(fù)合酶酶解

劉海梅[7]等采用Protemax復(fù)合蛋白酶水解牡蠣肉，得到水解度為27.28%的牡蠣多肽。姚玉靜[8]等選用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶深度酶解牡蠣，發(fā)現(xiàn)牡蠣深度酶解的最優(yōu)工藝條件為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為2∶1，該條件下得到的牡蠣深度酶解產(chǎn)物中分子量小于3 ku的多肽達(dá)到83.5%。張典[9]等采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶協(xié)同酶解牡蠣，得到的蛋白質(zhì)水解度和蛋白回收率分別為37.82%和71.87%。李園[10]等用無(wú)花果蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解牡蠣肉制備抗氧化酶解液，發(fā)現(xiàn)無(wú)花果蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的比例為5∶1（質(zhì)量比）時(shí)，該酶解液具有較高的抗氧化活性和蛋白質(zhì)回收率。

2.3 多種酶分步酶解

邱娟[11]等利用復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶分步酶解牡蠣，制備得到純度為99.72%分子質(zhì)量小于3 000 Da的具有ACE抑制作用的活性肽。胡雪瓊[12]等比較了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶不同組合的酶解效果，發(fā)現(xiàn)先用枯草桿菌中性蛋白酶，再加胰蛋白酶對(duì)牡蠣進(jìn)行程序酶解，可得到牡蠣糖胺聚糖含量為2.40%的粗提物。方富永[13]等利用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶3種酶依次對(duì)牡蠣進(jìn)行酶解，得到相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）在300～1 000的多肽。

2.4 酸酶結(jié)合水解

因?yàn)閱渭兠附獬杀咎?，酸水解成本低但無(wú)選擇性，為了酶解徹底，且節(jié)約成本，楊留明[14]等利用酸酶結(jié)合法水解牡蠣肽，即先用醋酸酸解，選擇胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶（質(zhì)量比為2∶1）酶解，得到水解度為36.25%±0.63%的牡蠣肽。

2.5 多糖多肽聯(lián)產(chǎn)加工技術(shù)

為了綜合開(kāi)發(fā)利用牡蠣多糖、多肽，楊大俏[15]等利用Alcalase酶、胰蛋白酶結(jié)合膜過(guò)濾，同時(shí)提取、分離牡蠣多糖和多肽，實(shí)現(xiàn)了牡蠣多糖及多肽的聯(lián)產(chǎn)技術(shù)。

3 酶解產(chǎn)物的活性作用

3.1 免疫調(diào)節(jié)作用

許丹[16]等研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肽可改善CTX所致免疫低下小鼠免疫器官結(jié)構(gòu)紊亂，恢復(fù)CTX造成的小鼠T淋巴細(xì)胞比例失調(diào)及細(xì)胞因子紊亂，升高骨髓有核細(xì)胞數(shù)及骨髓DNA含量，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。李婉[17]等研究發(fā)現(xiàn)牡蠣酶解產(chǎn)物可提高脾淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能，且小于2.5 kDa組分和2.5～5 kDa組分的免疫功能優(yōu)于其他組分。胡雪瓊[18]等采用小鼠體內(nèi)注射環(huán)磷酰胺（CTX）法建立免疫抑制動(dòng)物模型，牡蠣糖胺聚糖對(duì)正常小鼠免疫器官指數(shù)、抗體生成數(shù)和血清溶血素、細(xì)胞免疫、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞殺傷活性的均有顯著影響,表明其具有免疫增強(qiáng)功能。陳曉文[19]等研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肽可以增加免疫器官的相對(duì)重量和血清溶血素含量，并能顯著增加抗體生成細(xì)胞和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。劉淑集[20]等研究認(rèn)為牡蠣寡肽能夠顯著提高脾淋巴細(xì)胞的增殖能力、NK細(xì)胞活性、廓清指數(shù)K、吞噬指數(shù)a、吞噬中性紅能力、TNF－α、IL－6、溶血素水平和改善脾淋巴細(xì)胞CD3+4T淋巴細(xì)胞亞群及CD3+8T淋巴細(xì)胞亞群分布（P＜0.05），而對(duì)小鼠的肝、脾臟指數(shù)影響不顯著。

3.2 抗病毒作用

李江濱[21]等采用血凝滴度測(cè)定牡蠣多糖對(duì)流感病毒在狗腎細(xì)胞（MDCK）中增殖的抑制作用，結(jié)果表明牡蠣多糖能顯著降低和抑制狗腎細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒的血凝滴度。李萌[22—23]等研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣糖胺聚糖（O—GAG）能顯著降低Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV—1）感染小鼠的死亡率，延長(zhǎng)其存活時(shí)間，并明顯提高病毒感染小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，從而對(duì)感染Ⅰ型單純皰疹病毒的小鼠具有一定的治療作用，并能提高小鼠的免疫功能。

3.3 降血糖、血壓

王海桃[24]等研究了牡蠣提取物牡蠣糖胺聚糖對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型的影響發(fā)現(xiàn)，牡蠣糖胺聚糖對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)作用，能有效防止因血管內(nèi)皮損傷而引起的高血壓、動(dòng)脈硬化、腦卒中等多種心血管疾病。邱娟[11]等研究發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在3 000Da以下的牡蠣肽具有ACE抑制活性，其IC50為0.8 mg/mL，因此，牡蠣多肽具有降血壓作用。歐成坤[25]等研究認(rèn)為牡蠣經(jīng)酸性蛋白酶酶解得到的產(chǎn)物在ACE抑制活性、清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH·自由基方面均優(yōu)于或近似于Aclalase堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物。趙榮濤[2]研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶酶解得到的牡蠣多肽對(duì)α—淀粉酶的抑制效果最好，多肽濃度為5 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到67.13%，IC50值為3.806 mg/mL。

3.4 抗癌作用

李鵬[26]等用牡蠣活性肽，對(duì)人胃癌BGC—823細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)及其對(duì)胃癌細(xì)胞的作用做了研究。結(jié)果顯示，牡蠣活性肽能有效抑制胃癌BGC—823細(xì)胞的增殖活動(dòng)，出現(xiàn)亞G1期細(xì)胞，細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)，表明其具有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用。胡雪瓊[12]等采用四氮唑藍(lán)還原法（MTT法）研究牡蠣糖胺聚糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞）的體外抗腫瘤活性，結(jié)果顯示500 μg/mL 劑 量 組 與 600 μg/mL 劑量組48 h時(shí)的抑制率分別為43.1%（P＜0.05），55.8%（P＜0.05），因此近江牡蠣糖胺聚糖具有較明顯的抗腫瘤活性。

3.5 抗氧化

趙榮濤[2]等研究院發(fā)現(xiàn)，糜蛋白酶酶解得到的牡蠣多肽對(duì)超氧陰離子的抑制率最高，2 mg/mL時(shí)抑制率為53.64%，IC50值為1.75 mg/mL。魏穎[27]等研究認(rèn)為牡蠣肽主要含有相對(duì)分子量低于1 000 U的八肽以下的短肽，該短肽具有抑制細(xì)胞內(nèi)ROS生成的能力，并對(duì)ConA誘導(dǎo)的T—淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用。李茹[28]等研究發(fā)現(xiàn)用堿性蛋白酶酶解得到的牡蠣多肽具有最強(qiáng)的DPPH·自由基清除能力，其濃度為1 mg/mL時(shí)清除率最大。

3.6 抗衰老

李大煒[29]以不同劑量的牡蠣肽給大鼠灌胃4周，觀察各組間睪丸組織形態(tài)、生化指標(biāo)及精子質(zhì)量等差異，發(fā)現(xiàn)牡蠣肽能修復(fù)D—半乳糖致衰老大鼠睪丸組織的衰老形態(tài)；提高精子質(zhì)量、干細(xì)胞因子濃度。張雪妍[3]等研究認(rèn)為木瓜蛋白酶酶解得到的牡蠣多肽＜5 ku和5～10 ku超濾組分細(xì)胞增殖活性及促進(jìn)睪酮分泌的活性均最強(qiáng)。