周龍 王立林 胡序懷

[摘要]目的 篩選出小鼠原代肝細胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。方法 采用兩步膠原酶灌注法分離小鼠原代肝細胞，放入25 cm2膠原包被瓶中（1×106個/瓶），均分為5組：對照組（C組）、陰性對照組（NC組）、siR-996組、siR-1381組、siR-1519組。采用HiPerFect轉染試劑將各組對應的siRNA序列轉入小鼠原代肝細胞，24 h后提取RNA和蛋白，通過Real-time PCR檢測各組PTEN mRNA表達，通過Western blot檢測各組PTEN蛋白含量。結果 siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN蛋白含量低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN mRNA水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。siR-996組的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381組和siR-1519組。結論 siR-996是小鼠原代肝細胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。

[關鍵詞]小鼠原代肝細胞;PTEN磷酸水解酶;小干擾RNA;胰島素抵抗

[中圖分類號] R332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）3（b）-0022-04

胰島素抵抗是影響危重患者預后的重要因素[1-2]，丙泊酚在臨床上廣泛用于處于胰島素抵抗狀態(tài)患者的鎮(zhèn)靜和麻醉，但是丙泊酚對胰島素抵抗的影響及機制卻鮮有研究。本課題組先前研究發(fā)現[3]，丙泊酚可抑制小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路，引起小鼠原代肝細胞胰島素抵抗，但丙泊酚的作用靶點并不在GSK-3β，而是在其上游。PTEN是PI3K/Akt信號通路的重要調節(jié)基因[4-7]，處于GSK-3β上游，本課題組將選擇PTEN作為研究對象，試圖通過在基因水平對PTEN進行干擾，揭示丙泊酚所致胰島素抵抗的分子機制。所以，篩選出PTEN基因沉默所需的高效siRNA是關鍵，吉瑪基因公司以PTEN為靶基因，設計合成了3條siRNA供選擇，本實驗將這些siRNA轉染小鼠原代肝細胞，篩選出沉默效率最高的siRNA，為后續(xù)基因沉默實驗合理選擇siRNA提供依據，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

siRNA-996、siRNA-1381、siRNA-1519、陰性對照siRNA（吉瑪基因公司，上海），各組siRNA的序列見表1。細胞培養(yǎng)試劑（Invitrogen公司，美國），HiPerFect轉染試劑盒（Qiagen公司，德國），SDS-PAGE試劑（Bio-Rad Laboratories公司，美國），兔抗PTEN抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，美國），M-MLV逆轉錄酶（Promega公司，美國），Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）。雄性C57BL/6小鼠由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供[許可證號：SCXK（京）2016-0010]。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組? 采用兩步膠原酶灌注法分離小鼠原代肝細胞[8-9]，收集細胞于50 ml離心管中，800 r/min，8 min離心，棄上清液，用細胞培養(yǎng)基重新懸浮，顯微鏡下臺盼藍染色觀察活細胞，計數，調整細胞密度，放入25 cm2膠原包被瓶中（1×106個/瓶）。這些細胞均分為5組：對照組（C組）;陰性對照組（NC組）：加入終濃度為50 nmol/L的陰性對照siRNA;siR-996組：加入終濃度為50 nmol/L的siR-996;siR-1381組：加入終濃度為50 nmol/L的siR-1381;siR-1519組：加入終濃度為50 nmol/L的siR-1519。

1.2.2 siRNA轉染? 按HiPerFect轉染試劑盒說明書，在24孔板中每孔加入6×104個小鼠原代肝細胞，用含100 U/ml青霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至500 μl，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中。用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋75 ng siRNA至終濃度為50 nmol/L，然后加入3 μl HiPerFect轉染試劑，輕搖混勻，室溫下靜置10 min。將混合物逐滴加入培養(yǎng)皿中，混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 PETN蛋白檢測? 先用RIPA裂解緩沖液提取各組細胞中的總蛋白，再用BCA法檢測蛋白含量。每組上樣30 μg總蛋白經10%SDS-PAGE凝膠行恒壓電泳，將其轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入1：1000稀釋的PTEN和β-actin一抗，4℃孵育過夜，加入1：3000稀釋的辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫孵育1 h，洗膜后采用ECL化學發(fā)光顯影，最后用Gel-Pro Analyzer分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 PTEN mRNA檢測? 按Trizol試劑盒的說明書提取細胞總的RNA。逆轉錄反應按照M-MLV逆轉錄酶試劑盒的說明書操作。PTEN上游引物：3′-TGTATCGCGGAGACTGACCCTTAA-5′，PTEN下游引物：5′-GATTGCAAGTTCCGCCACTGAACA-3′。HPRT1上游引物：3′-TCGTTCTGCAAGTCAGGACAGGTATTAA-5′，HPRT1下游引物：5′-TCCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTATAGC-3′。PCR的反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。PCR完畢后以HPRT1作為內參基因，采用SDS軟件分析產物熔解曲線。

1.3觀察指標及評價標準

比較NC組、siR-996組、siR-1381組、siR-1519組的PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平。PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平的沉默效率與各組的PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平成反比，含量或水平越低，表明其沉默效率越高。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN蛋白含量低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN mRNA水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（表2）。siR-996組的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381組和siR-1519組。

3討論

胰島素抵抗是指正常劑量的胰島素所產生的生物學效應降低的一種現象，不僅存在于糖尿病，還可以存在于其它許多病理情況下，甚至于生理情況下[10-14]。胰島素抵抗是導致手術患者和危重患者發(fā)生應激性高血糖的重要機制之一[1-2]。丙泊酚是當前臨床上最常用的靜脈麻醉劑，被廣泛用于手術患者的麻醉，而且還常用于危重患者的鎮(zhèn)靜。在當前臨床實踐中丙泊酚常用于處在胰島素抵抗狀態(tài)的危重患者，但是丙泊酚對胰島素抵抗的影響或機制卻少有研究。先前研究表明[15]，丙泊酚可引起大鼠全身性胰島素抵抗，但具體的分子機制尚不清楚。本課題組研究發(fā)現[3]，丙泊酚能抑制小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路，從而抑制糖原合成，同時還發(fā)現丙泊酚的作用靶點并不在GSK-3β，而是在GSK-3β的上游。PTEN處于GSK-3β的上游，是PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的重要調節(jié)基因[4-7]，因此在后續(xù)研究中課題組將PTEN列為觀察對象，試圖通過在基因水平對PTEN進行干擾，探究丙泊酚對小鼠原代肝細胞PTEN表達的影響。所以，篩選出PTEN基因沉默所需的高效siRNA是當前研究的關鍵。吉瑪基因公司以PTEN為靶基因，設計合成了3條siRNA供選擇：siR-996、siR-1381和siR-1519。本實驗采用siR-996、siR-1381和siR-1519轉染小鼠原代肝細胞，評價3種siRNA各自的沉默效率，旨在篩選出沉默效率最高、效果滿意的的siRNA，為后續(xù)PTEN基因沉默實驗選擇較為理想的siRNA。

PTEN是第一個被人類發(fā)現的具有磷酸酶活性的抑癌基因[16-17]，PTEN編碼的蛋白在細胞漿中表現出雙重特異性磷酸酶活性，在細胞周期阻滯和細胞凋亡過程中起重要作用。PTEN蛋白募集到細胞膜上，發(fā)揮脂質磷酸酶作用，使多種蛋白質磷酸化，從而影響多條信號傳導通路，最終對基因轉錄進行調控。PTEN被認為是PI3K/Akt信號轉導的重要調節(jié)基因，PTEN結合到質膜后可催化抑制PIP3生成的反應，從而調控PI3K/Akt信號通路的轉導[4-7]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是生物體內特定基因表達受到抑制的一種現象。當細胞內導入雙鏈RNA或短發(fā)夾RNA時，與之互補的內源性mRNA編碼區(qū)將裂解，從而導致基因沉默[18]。雙鏈RNA經外界進入細胞，被Dicer酶識別而被加工成21-25nt的雙鏈RNA，這些短雙鏈RNA在沉默通道中發(fā)揮主要作用，是特定mRNA被降解的主要因素，被稱為小干擾RNA（siRNA）。與目標mRNA互補的siRNA可介導沉默復合體，特異性地降解與之高度互補的靶mRNA，從而抑制靶基因表達[19-20]。HiPerFect轉染試劑是一種中性脂和陽離子組成的混合物，可有效攝入siRNA并釋放細胞內的siRNA，基因敲除效率較高。設立對照是評估RNAi實驗可信度的重要因素，本研究設立陰性對照主要是用來評估RNA干擾的特異性。本研究結果提示，siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN蛋白含量低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN mRNA水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。siR-996組的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381組和siR-1519組。提示基因公司提供的3種siRNA都可不同程度地抑制PTEN表達，但以siR-996抑制程度最深、效果最滿意，與NC組比較，其PTEN蛋白表達和PTEN mRNA表達均下降較多。

綜上所述，本研究以PTEN為靶基因，觀察比較了3種不同siRNA的沉默效率，其中siR-996的沉默效率最高，是PTEN基因沉默實驗較為理想的選擇。

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（收稿日期：2018-09-25? 本文編輯：孟慶卿）