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(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是多基因、多因素共同參與的過程，隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的改變密切相關(guān)。人程序化死亡分子5(human programmed cell death 5，PDCD5)基因在細(xì)胞的凋亡過程中起著關(guān)鍵性作用，在體外能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，明顯促進(jìn)其凋亡[1]。白黎蘆醇是從葡萄、花生、虎杖等藥用植物中提取的有效成分，在體外能上調(diào)多種腫瘤細(xì)胞株中PDCD5的表達(dá)[2-4]，本實(shí)驗(yàn)旨在探討PDCD5在宮頸癌Hela細(xì)胞中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，為宮頸癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料人宮頸癌Hela細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；白黎蘆醇購自西安天行健生物公司；5’端生物素標(biāo)記PDCD5 cDNA探針 (5’CGG CCA GCC TCT GTC TCC TCA 3’)購自北京奧科生物技術(shù)公司；PDCD5免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1 免疫細(xì)胞化學(xué) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測宮頸癌Hela細(xì)胞中PDCD5蛋白表達(dá)，將宮頸癌Hela細(xì)胞進(jìn)行分組，分別用25、50、100、200 μmol·L-1白藜蘆醇處理宮頸癌Hela細(xì)胞24、48、72 h，以培養(yǎng)基代替白黎蘆醇作為空白對照組；用已知PDCD5陽性表達(dá)的正常宮頸組織切片做陽性對照[5]。

1.2.2 原位雜交 采用原位雜交檢測宮頸癌Hela細(xì)胞中PDCD5 mRNA表達(dá)，用RNase酶(0.1 g·L-1)預(yù)處理細(xì)胞滴片，酶解細(xì)胞內(nèi)的mRNA，嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行。用無探針的雜交液作為空白對照組，用已知PDCD5陽性表達(dá)的正常宮頸組織切片作為陽性對照。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)和原位雜交結(jié)果判定 陽性信號均定位于宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，免疫細(xì)胞化學(xué)強(qiáng)陽性染色為黃褐色，原位雜交強(qiáng)陽性染色為紫藍(lán)色，每張滴片隨機(jī)選5個視野(100×)，按著色深淺和陽性細(xì)胞百分比來判定結(jié)果[5-7]：1)陽性細(xì)胞數(shù)：<1%為0分，1%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；2)細(xì)胞著色強(qiáng)度的計(jì)分：無染色為0分，淡黃色或淡藍(lán)色為1分，棕黃色或藍(lán)色為2分，棕褐色或紫藍(lán)色為3分。綜合2項(xiàng)得分進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.4 TUNEL法 采用TUNEL法檢測宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡情況，宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞核呈黃褐色為凋亡陽性，細(xì)胞核不染色為陰性。以公式計(jì)算凋亡指數(shù)[6]。

2 結(jié)果

2.1白黎蘆醇對宮頸癌Hela細(xì)胞中PDCD5蛋白、mRNA表達(dá)的影響4種不同濃度的白黎蘆醇分別處理宮頸癌Hela細(xì)胞24、48、72 h后，與空白對照組比較，PDCD5蛋白、mRNA的表達(dá)均有明顯升高，且白藜蘆醇的濃度越高，其表達(dá)也越高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；同一濃度白藜蘆醇處理組中，隨著時(shí)間延長，PDCD5蛋白、mRNA的表達(dá)也均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

2.2白黎蘆醇對宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響4種不同濃度的白黎蘆醇分別處理宮頸癌Hela細(xì)胞24、48、72 h后，與空白對照組比較，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，且隨白藜蘆醇的濃度的增加而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但同一濃度白藜蘆醇處理組細(xì)胞凋亡指數(shù)隨白藜蘆醇的作用時(shí)間延長增加均不顯著，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表1 白黎蘆醇對宮頸癌Hela細(xì)胞PDCD5蛋白、mRNA表達(dá)的影響

表2 白藜蘆醇對宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

白藜蘆醇屬于多酚類化學(xué)物，在虎杖、花生、葡萄等植物內(nèi)含量較高。有研究[8]證實(shí)白藜蘆醇有抗炎、抗血小板聚集、清除自由基、抗氧化、心血管保護(hù)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抗腫瘤增殖等作用。關(guān)于白藜蘆醇對腫瘤作用的研究[9]證實(shí)，白藜蘆醇對乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌等都有一定的抗腫瘤作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長并促進(jìn)其凋亡。

細(xì)胞凋亡過程的紊亂與許多腫瘤的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系。PDCD5基因在細(xì)胞的凋亡過程中起著關(guān)鍵性作用，可以誘導(dǎo)和促進(jìn)凋亡。PDCD5在人體正常的睪丸、腎上腺、胎盤、腎臟等組織中高表達(dá)，而在胚胎組織、腫瘤組織中低表達(dá)或不表達(dá)[10]。

本實(shí)驗(yàn)中我們用不同濃度的白藜蘆醇處理宮頸癌Hela細(xì)胞，不同時(shí)間段不同濃度白藜蘆醇組PDCD5蛋白、mRNA表達(dá)均有增高，說明白藜蘆醇可以通過上調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞中PDCD5的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。我們用TUNEL方法檢測白藜蘆醇處理宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡情況，證實(shí)白藜蘆醇可以提高宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡指數(shù)，說明白藜蘆醇在體外可以促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡。

綜上所述，白藜蘆醇可以通過上調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞中PDCD5的表達(dá)，促進(jìn)和誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡，從而有望成為宮頸癌治療新的輔助方法。