王銀輝，劉國英，湯有宏，何宏魁，馬　雷，沈小梅(1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州236820；2.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽亳州236820)

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超高效合相色譜法同時測定米酒中4種脂溶性維生素方法的研究

王銀輝，劉國英，湯有宏，何宏魁，馬雷，沈小梅
(1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州236820；2.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽亳州236820)

摘要：為檢測米酒中微量維生素（維生素A、維生素B1、維生素C、維生素K），建立了一種利用超高效合相色譜串接二極管陣列檢測器的檢測方法。樣品經(jīng)過正己烷萃取前處理后，以BEH C18色譜柱為分離柱，CO2和甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)超高效合相色譜（UPC2）分離，采用二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測。4種維生素線性范圍在

5～25μg/mL內(nèi)，擬合所得線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。在3個加標(biāo)水平下，得到樣品平均回收率為97.1 %～

111.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均控制在5 %以內(nèi)。該方法簡單快捷、準(zhǔn)確可靠，可用于米酒中4種脂溶性維生素的同時檢測。

關(guān)鍵詞：脂溶性維生素；合相色譜分離術(shù)；超高效合相色譜儀；米酒

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-01-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160122.1023.009.html。

脂溶性維生素（FSV）包括維生素A、D、E、K及類胡蘿卜素（例如β-胡蘿卜素）。脂溶性維生素參與許多與重要生理功能相關(guān)的復(fù)雜代謝反應(yīng)，例如視力（維生素A）、鈣吸收（維生素D）、細(xì)胞膜的抗氧化（維生素E）及血液凝固（維生素K）。米酒營養(yǎng)豐富，含18種氨基酸，含多種蛋白質(zhì)和糖類、維生素和礦物質(zhì)，這些物質(zhì)大部分都是大米中本身含有的，但它們的結(jié)合形式產(chǎn)生了變化，另根霉在發(fā)酵時也會產(chǎn)生一些維生素。β-胡蘿卜素是維生素A的前體，且在人體內(nèi)具有100 %維生素A活性[1]。番茄紅素不是人體的必需營養(yǎng)素，但它的抗氧化性能使它廣受歡迎，越來越多地與其他成分一起被添加到某些膳食補(bǔ)充劑中。但是，人們也越來越關(guān)注從營養(yǎng)補(bǔ)充劑以及營養(yǎng)強(qiáng)化食品中所攝取的脂溶性維生素的安全性問題，特別是維生素A和D，若過量食用，也會帶來嚴(yán)重的健康風(fēng)險。在許多國家，許多針對營養(yǎng)強(qiáng)化食品及膳食補(bǔ)充劑中所添加微量元素的合規(guī)性的法律正在擬定或制定中，因此，市場上必然對能夠快速、準(zhǔn)確地分析不同產(chǎn)品中的脂溶性維生素含量的分析方法有更高的需求[2]。目前，在進(jìn)行FSV分離時，最常使用的是液相色譜（LC）法，反向（RP）與正向（NP）方法均有[1，2-4]。雖然AOAC法可用于對食品及營養(yǎng)補(bǔ)充劑當(dāng)中的各種脂溶性維生素分別進(jìn)行定性與定量分析，但卻缺少一種可對維生素預(yù)混物中的脂溶性維生素以及類胡蘿卜素同時進(jìn)行分析的方法。由于超高效合相色譜（UPC2）分離速度快、經(jīng)濟(jì)耐用，因此可考慮將其用于對含有多種脂溶性維生素的藥物制劑進(jìn)行快速分析。本研究闡述了一種單次進(jìn)樣方法，它可在5 min內(nèi)同時分離4種脂溶性維生素。優(yōu)化后的方法在保留時間以及峰面積方面具有良好的重現(xiàn)性，且可用于進(jìn)行高通量定量分析。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

實驗酒樣：市場上銷售的米酒。

超高效合相色譜儀，Waters ACQUITY UPC2，配備有二極管陣列檢測器與Empower3色譜處理系統(tǒng)；Milli-Q超純水裝置，美國Millipore公司。

維生素A、維生素B1購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，維生素C、維生素K購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

甲醇、異丙醇為LC-MS級，購自美國Fisher公司；正己烷為LC-MS級，購自ACS恩科化學(xué)和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm水系微孔濾膜購自上海安譜公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取0.10 g維生素A標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配制成1 mg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

精確稱取0.25 g維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配制成2.5 mg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

精確稱取0.10 g維生素C標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

精確稱取0.10 g維生素K標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

準(zhǔn)確移取適量4種單標(biāo)儲備液混合于50 mL容量瓶中，用正己烷稀釋并定容，配制成2.5 μg/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)工作液；移液槍精確移取適量的中間標(biāo)準(zhǔn)工作液，用正己烷配制成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.3樣品前處理方法

移取5 mL樣品于10 mL比色管中，加入2 mL正己烷，渦旋1 min，靜置5 min，移取1.5 mL上層溶液注入2 mL樣品瓶，待進(jìn)樣。

1.4色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（3.0×100 mm, 1.7μm）；柱溫：30℃；樣品室溫度：15℃。

流動相：二氧化碳(A) +甲醇（B）；流速：1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；進(jìn)樣量：1μL；時間：5 min；ABPR壓力：1885 psi。

二極管陣列檢測器PDA:3D通道：210～600 nm；分離度：1.2 nm；采樣速率：20點/s。

梯度洗脫程序見表1。

表1　超高效合相色譜梯度洗脫條件

2　結(jié)果與討論

2.1流動相中輔助溶劑的選擇

UPC2系統(tǒng)中少量的有機(jī)溶劑對分析物的分離具有重要的作用，不同的有機(jī)溶劑具有不同的選擇性和洗脫能力。超臨界CO2作為UPC2的主要流動相，可與全部有機(jī)溶劑互溶，因而為輔助溶劑的選擇提供了更寬的范圍。文獻(xiàn)[5]中基本上均采用異丙醇作為輔助溶劑。本實驗討論了4種有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈、異丙醇和乙醇）對4種維生素分離的影響。通過實驗可知：4種有機(jī)溶劑對脂溶性維生素的洗脫能力大小順序為甲醇＞乙醇＞異丙醇＞乙腈，且選擇差異性明顯，其中甲醇和異丙醇分離效果較好(見圖1)，但異丙醇黏度較高，柱壓偏高，且峰型較寬；乙腈和乙醇分離的峰型較差，因此本實驗選擇甲醇作為輔助有機(jī)溶劑。

圖1　4種維生素的標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖

2.2柱溫及系統(tǒng)備壓的優(yōu)化

文獻(xiàn)[3]中提到UPC2與一般的液相色譜相比，分離溫度和壓力的改變能夠更為顯著的改變流動相的密度，從而改變其分離能力。較高的柱溫導(dǎo)致流動相的密度變小而增加保留時間，較高的壓力導(dǎo)致流動相的密度變大而縮短保留時間，因此溫度和壓力是建立UPC2方法中的兩個重要參數(shù)。通常UPC2可設(shè)置的柱溫為35～65℃，壓力為11.72～24.14 MPa，但壓力低于12.41 MPa時，CO2會從超臨界狀態(tài)變?yōu)楦咏鼩鈶B(tài)的狀態(tài)，影響其極性和密度，最終影響分析物的分離效果。本實驗考查了不同的柱溫和不同備壓對維生素分離效果的影響，最終將柱溫設(shè)置為60℃，系統(tǒng)備壓設(shè)為13.10 MPa。

2.3紫外檢測波長的選擇

采用3D檢測模式，掃描一個波長段，分別對4種單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描，掃描范圍為210～600 nm，維生素的標(biāo)準(zhǔn)品3D掃描圖見圖2。從3D掃描圖中可以看出，在254 nm處，吸收較好，再結(jié)合工作效率和靈敏度，采用254 nm對4種物質(zhì)同時進(jìn)行掃描檢測。

圖2　4種維生素的標(biāo)準(zhǔn)品的3D譜圖

2.4樣品前處理條件的優(yōu)化

有關(guān)維生素檢測的文獻(xiàn)[4]以及本實驗室常用的前處理方法有甲醇[6]、三氯甲烷、四氫呋喃超聲提取。本研究實驗了以上的提取方法，三氯甲烷和四氫呋喃的效果較差，如圖3所示使用三氯甲烷作為萃取劑米酒中維生素的譜圖和圖4所示的使用四氫呋喃作為萃取劑米酒中維生素的譜圖，都不能很好地從米酒中提取4種維生素，而且樣品中維生素的峰型較差。因此，綜合考慮，本實驗選用了正己烷作為萃取劑。

圖3　使用三氯甲烷作為萃取劑米酒中維生素的譜圖

圖4　使用四氫呋喃作為萃取劑米酒中維生素的譜圖

2.5方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

使用中間標(biāo)準(zhǔn)工作液配制質(zhì)量濃度范圍在5～25 μg/ mL的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，利用已優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定，以待測物的峰面積對其相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9998，以3倍信噪比測定方法的檢出限（S/N=3），具體結(jié)果見表2。

表2　4種維生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.6方法精密度和加標(biāo)回收率

選用同一個米酒樣品經(jīng)前處理后作為空白樣品，分為3份，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，3個質(zhì)量濃度加標(biāo)水平分別為6 μg/mL、15 μg/mL、23 μg/mL，在上述實驗條件下，將每個濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)性實驗，計算得出平均回收率為97.10 %～111.33 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0 %，方法精密度和加標(biāo)回收率均良好，具體結(jié)果見表3。

表3　4種維生素的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.7實際樣品分析

運(yùn)用本實驗所建立的分析檢測方法，對實驗室內(nèi)留存的20個米酒樣品進(jìn)行4種維生素(維生素A、維生素B1、維生素K和維生素C)的檢測分析，檢測數(shù)據(jù)見表4。本方法能夠滿足對米酒中維生素A、維生素B1、維生素K和維生素C 4種維生素同時檢測的要求。

3　結(jié)論

本研究使用超高效合相色譜儀（配置二極管陣列檢測器）建立了應(yīng)用于米酒中4種維生素(維生素A、維生素B1、維生素K和維生素C)同時檢測的分析方法。米酒樣品經(jīng)正己烷萃取處理后進(jìn)樣分析，該方法可實現(xiàn)4種維生素的完全分離，平均回收率為97.10 %～111.33 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0 %，能夠滿足4種物質(zhì)的檢測和回收，且方法簡便快捷、科學(xué)可靠，在米酒中維生素檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。

表4　20個酒樣中4種維生素的檢測數(shù)據(jù)　(μg/mL)

注：ND表示未檢出。

參考文獻(xiàn)：

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ultra performance convergence chromatography：720004394en [R]. Waters Corporation Note, 2012.

Simultaneous Determination of Four Kinds of Fat-soluble Vitamins in Rice Wine by Ultra-performance Convergence Chromatography (UPC2)

WANG Yinhui, LIU Guoying , TANG Youhong, HE Hongkui , MALei and SHEN Xiaomei
（1.Anhui Gujing Gongjiu Distillery Co. Ltd., Bozhou,Anhui 236820; 2.Anhui Engineering Research Center of Solid-state Brewing, Bozhou,Anhui 236820, China）

Abstract:In order to detect trace vitamins (vitamin A, vitamin B1, vitamin C and vitamin K) in rice wine, the method of a diode array detector by UPC2 had been developed. Wine samples were pretreated by hexane extraction, then gradient elution was operated with BEH C18column as the separation column and CO2and methanol as the mobile phase. After UPC2separation, a diode array detector was applied for the detection. The linear range of four kinds of vitamins was in 5～25 μg / mL, and the fitting linear correlation coefficients were above 0.999. In the three spiked level, the average recoveries were 97.1%～111.3 % and RSD was controlled within 5%. Such method was simple and fast with high accuracy and it could be used for simultaneous determination of four fat-soluble vitamins in rice wine.

Key words:fat-soluble vitamins; convergence chromatography; UPC2; rice wine

作者簡介：王銀輝，男，工程師，安徽古井貢酒股份有限公司技術(shù)中心研究專員，發(fā)表論文多篇。

收稿日期：2015-09-07； 2015-11-27

DOI：10.13746/j.njkj.2015364

中圖分類號：TS262.4；TS261.4；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）03-0084-04