新型肽對Lewis腫瘤細胞的作用

王溪原史育萌1錢鑫1匡野2趙志濤王毅周慶偉

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧沈陽110032)

摘要〔〕目的探討新型肽對Lewis腫瘤細胞的抑制作用。方法采用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測Lewis腫瘤細胞在不同時間段(24、48、72 h)細胞增殖活性，構(gòu)建C57BL/6N純系小鼠肺癌模型，免疫組化法檢測細胞周期蛋白D1陽性表達。結(jié)果Lewis腫瘤細胞在給藥48 h，新型肽對腫瘤細胞的增殖具有明顯抑制作用，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)；在連續(xù)給藥21 d后，腫瘤體積明顯縮小，抑制率為43.38%；細胞周期蛋白D1陽性表達明顯降低，與空白對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論新型肽可能通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1的表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤生長作用。

關(guān)鍵詞〔〕新型肽；細胞增殖；肺腫瘤；細胞周期蛋白D1

中圖分類號〔〕R73〔

通訊作者：周慶偉(1959-)，男，博士，主要從事藥理學(xué)研究。

1長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2吉林大學(xué)藥學(xué)院

第一作者：王溪原(1969-)，男，博士，副教授，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

目前臨床上以手術(shù)、放射治療和化療為肺癌的主要治療手段〔1〕。迄今國內(nèi)外已研究的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價格昂貴且不良反應(yīng)大，同時也存在耐藥性問題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制〔2，3〕。為此，尋找高效、低毒、價廉且能有效提高療效的藥物治療肺腫瘤是亟需解決的問題。本實驗旨在研究一種新型肽對Lewis腫瘤細胞增殖的抑制作用，并通過抑瘤實驗及細胞周期蛋白(Cyclin)D1的表達，初步探討其抑制腫瘤細胞可能的作用機制，為研究新型肽治療肺腫瘤提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細胞、主要試劑及藥品Lewis肺癌細胞株：購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。主要試劑：①細胞周期檢測試劑盒(產(chǎn)品編號：C1052)，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；②二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)均為美國Sigma 公司產(chǎn)品；③新型肽由上海吉爾公司合成，純度為98%；④博來霉素由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供(批號：H20055883)。

1.2主要儀器①顯微鏡(日本尼康公司)；②二氧化碳培養(yǎng)箱 (日本三洋電機株式會社制造，產(chǎn)品型號：NCO-15AC)；③AN YANG超凈臺(中國蘇州安洋科技發(fā)展有限公司,型號：BSC-BOOⅡB2)；④流式細胞儀(美國becton-Dickson公司)；⑤酶標(biāo)儀(上海BIO-RAD公司，MODEL550型)。

1.3方法

1.3.1MTT法檢測細胞存活率取對數(shù)生長期Lewis腫瘤細胞，常規(guī)胰酶消化，制成單細胞懸液并計數(shù)，以每孔1×104/ml接種于96孔板中，100 μl/孔，終體積為200 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，待細胞貼壁后，隨機分為空白對照組、博來霉素組及不同濃度新型肽(450 μg/ml、900 μg/ml及1 800 μg/ml)組，20 μl/孔，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液，每組分別設(shè)5個復(fù)孔。置入37℃、5%CO2培養(yǎng)，分別孵育24、48、72 h，每孔加入20 μl MTT孵育4 h，以DMSO每孔150 μl終止反應(yīng)。將96孔板移入平板振蕩器，水平振蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長測定吸光度(A)值，以空白對照孔A值調(diào)零，記錄結(jié)果。

1.3.2肺腫瘤模型的建立選用6周齡的C57BL/6N純系小鼠共計30只，體重18～22 g，每鼠在左腹股溝皮下接種0.2 ml Lewis腫瘤細胞(細胞數(shù)為1×107/ml)，隨機分為模型組、博來霉素組及新型肽組，每組10只，博來霉素組腹腔注射1.04 mg/kg，新型肽組腹腔注射24 mg/kg，模型組注射同體積的生理鹽水。接種瘤細胞后第2天開始給藥，1次/d，連續(xù)21 d，末次給藥后24 h處死小鼠，取瘤塊并稱重，計算抑瘤率。

1.3.3免疫組織化學(xué)法檢測①腫瘤組織取材，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片(4 μm)，組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；②抗原修復(fù)，將切片侵入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中，微波爐加熱至拂騰，冷卻后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗；③滅活內(nèi)源性氧化物酶：30%H2O2一份+蒸餾水九份混合，室溫5～10 min，以滅活內(nèi)源性酶；④正常血清封閉液(5%BSA封閉液)室溫20 min；⑤ 滴加一抗(Cyclin D1，1∶300稀釋)，濕盒中4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗；⑥ 滴加小鼠生物素二抗，37℃孵育20 min；PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈親和素，37℃下孵育20 min，PBS沖洗；⑦滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，室溫顯色，光鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水沖洗；⑧ 蘇木素復(fù)染，5～10 s，自來水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后，鏡下觀察。拍照。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測細胞活性不同劑量新型肽作用Lewis肺癌細胞，在24 h時，各實驗組之間抑制作用無顯著性差異(P>0.05)。在48 h時，新型肽對Lewis細胞具有明顯的抑制作用，新型肽組與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)，在72 h時，博來霉素組與新型肽不同劑量組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1　新型肽對Lewis腫瘤細胞活性

與空白對照組比較：1)P<0.05

2.2新型肽對C57BL/6N純系小鼠腫瘤抑制作用的影響新型肽在連續(xù)給藥21 d、劑量為24 mg/kg時對C57BL/6N小鼠腫瘤具有明顯抑制作用，其抑制率為43.38%，與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，新型肽組與博來霉素組比較無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2　新型肽對C57BL/6N純系小鼠腫瘤的

與模型組比較:1)P<0.05

2.3新型肽對Cyclin D1表達的影響模型組陽性細胞數(shù)量顯著多，陽性信號表達較強，呈深棕黃色，新型肽組Cyclin D1陽性細胞(42.26±3.36)明顯較少,與模型組(55.50±4.87)比較差異顯著(P<0.05)，博來霉素組Cyclin D1陽性細胞數(shù)量(43.51±3.96)也明顯減少，且陽性細胞的信號表達較弱，與模型組比較差異顯著(P<0.05)。

3討論

肺癌是全球普遍發(fā)生的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤之首。由于該疾病的發(fā)病機制目前仍不清楚，其治療一直沒有重大突破。傳統(tǒng)治療主要通過手術(shù)，并聯(lián)合化療、放療減少腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，但其治愈率仍較低，至今尚無突破性進展，故肺腫瘤的有效治療手段仍是臨床研究的熱點。

腫瘤的發(fā)生是多途徑、多步驟的，還與細胞凋亡有關(guān)，細胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡已成為腫瘤治療的重要手段之一〔4，5〕。有研究表明〔6〕，細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4、Rb參與細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換，Cyclin D1、CDK4 表達異常及 Rb 蛋白的磷酸化狀態(tài)與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1通過激活CDK4，介導(dǎo)Rb蛋白的磷酸化使得細胞越過調(diào)控點，進入S期，細胞過度增殖而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究提示新型肽對腫瘤細胞的抑制作用可能通過下調(diào)靶基因Cyclin D1蛋白的表達抑制細胞 DNA 的合成，誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

4參考文獻

1Genova C，Rijavec E，Barletta G,etal.Afatinib for the treatment of advanced non-small-cell lung caner〔J〕.Exper Opin Pharmacother，2014;15(6):889-903.

2Okada M，Sato A，Shibuya K.JNK contributes to temozolomide resistance of stem-like glioblastoma cells via regulation of MGMT expression〔J〕.Int J Oncol，2014;44(2):591-9.

3Sze CI，Su WP，Chiang MF，etal.Assessing current therapeutic approaches to decode potential resistance mechanisms in glioblastomas〔J〕.Front Oncol，2013;3(1):59.

4方艷秋，齊亞靈，白曉，等.Survivin反義核苷酸對肝細胞株SMMC-7721增殖的影響〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013;39(2):278-81.

5Bartuzi P，Hofker MH，van de Sluis B.Tuning NF-κB activity:a touch of COMMDD proteins〔J〕.Biochim Biophys Acta，2013;1832(12):2315-21.

6Chen B，Pan H，Zhu L,etal.Progesterone inhibits the estrogen-induced phosphoinositide 3-Kinase→AKT→GSK-3β→Cyclin D1→pRB pathway to block uterine epithelial cell proliferation〔J〕.Mol Endocrinol，2005;19(8):1978-90.

〔2013-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)