胡武杰　劉志明　吳斯敏　全軍利　李建林

[摘要]目的：通過RNA干擾乳腺癌MCF-7細(xì)胞組蛋白去乙?；?（HDACI）基因，觀察對其細(xì)胞周期及細(xì)胞生長的影響。方法：將乳腺癌MCF-7細(xì)胞分成3個(gè)組：空白對照組（不予任何處理）、陰性對照組（予以陰性siRNA+脂質(zhì)體）、siRNA組（HDACl siRNA+脂質(zhì)體）。人工合成針對HDACl基因的小分子干擾RNA構(gòu)建HDACI-siRNA重組質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入乳腺癌MCF-7細(xì)胞。用Real Time-PCR法和Western-b10t法分別檢測HDACl基因的mRNA及蛋白表達(dá)情況；MTT法檢測細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染24h后人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HDAClmRNA表達(dá)量在siRNA組為（0.15±0.02）、空白對照組為（1.00±0.03）、陰性對照組（0.83±0.04）。與空白對照組和陰性對照組相比，siRNA組細(xì)胞中HDAClmRNA表達(dá)量下降明顯（P<0.05）。Western b1ot顯示HDACl蛋白表達(dá)量亦明顯顯示：siRNA組表達(dá)量比空白和陰性對照組低（P<0.05）。MTT法檢測顯示3組細(xì)胞中，siRNA組的細(xì)胞生長速度較其他兩組慢（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示3組乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布顯示siRNA組細(xì)胞周期s期明顯減少（P<0.05），G1期比例增加（P<0.05）。結(jié)論：通過RNA干擾能有效的抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞HDAC1的表達(dá)，同時(shí)抑制細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞周期停滯。

[關(guān)鍵詞]HDAC1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）和組蛋白去乙酰化酶（HDAC），是一對功能相互拮抗的蛋白酶，共同負(fù)責(zé)調(diào)控組蛋白的乙?；c去乙?；?。正常細(xì)胞體一旦出現(xiàn)核內(nèi)組蛋白乙?；c去乙酰化的失衡，即會導(dǎo)致正常的細(xì)胞周期與細(xì)胞代謝行為的改變而誘發(fā)腫瘤。已有研究表明，由于這對拮抗酶活性的改變，導(dǎo)致組蛋白在轉(zhuǎn)錄水平異常修飾，導(dǎo)致異常表達(dá)。

在組蛋白去乙?；副姸鄟喰椭?，HDAC1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系中是具有代表性的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)HDAC1的表達(dá)水平與患者生存率，腫瘤的大小有關(guān)。因此HDAC1可以作為一個(gè)獨(dú)立的乳腺癌臨床預(yù)后指標(biāo)。其機(jī)制可能因?yàn)橄抡{(diào)HDAC1后，是HDAC1 mRNA和蛋白表達(dá)量減少。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過RNA干擾的手段，下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HDAC1基因的表達(dá)，使HDAC1基因表達(dá)減少，從而抑制細(xì)胞增長、使細(xì)胞周期發(fā)生改變。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑

乳腺癌MCF-7細(xì)胞（上海生物工程公司）。DMDM（美國Gibco公司）；小鼠抗人HDAC1單克隆抗體及羊抗小鼠二抗購自（美國SANTA CRUZ）公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；Real Time-PCR檢測試劑盒購自（上海吉馬技術(shù)制藥有限公司）公司；胎牛血清購自（維森特生物技術(shù)有限公司）公司；雙抗購自Gibco公司。

1.2主要的設(shè)備

CO₂培養(yǎng)箱（3111，美國Thermo）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、常溫離心機(jī)（3300，德國Eppend～f公司）、流式細(xì)胞儀（美國BD公司）、SDS-PAGE蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）、PCR儀（美國Applied Biosystems公司）

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO₂體積分?jǐn)?shù)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 RNA干擾片段的合成

siRNA序列委托上海吉瑪公司合成，同時(shí)合成隨機(jī)性陰性對照序列。HDAC1siRNA正義鏈：5'一GCUCCUCUGACAAACGAAUTT-3'，反義鏈5'-AUUCGUUUGUCAGAGGAGCTT-3'。陰性的siRNA正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'反義鏈-5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

RNA干擾具體轉(zhuǎn)染步驟參照上海吉瑪公司轉(zhuǎn)染操作手冊。轉(zhuǎn)染6～7h后換成無雙抗的DMEM培養(yǎng)液，之后常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后做后續(xù)處理。

1.5 Real Time-PCR法檢測乳腺癌HDAC1細(xì)胞中HDACl的表達(dá)

搜集轉(zhuǎn)染后各組HDAC1細(xì)胞，采用Trizo法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，檢測HDAC1、β-actm'的表達(dá)。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。β-actm'為內(nèi)參照計(jì)算相對表達(dá)量（RQ）

1.5Western blot法測MCF-7細(xì)胞中HDAC1蛋白的表達(dá)

提取并分離各組總蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，封閉轉(zhuǎn)移膜，分別加入一抗（兔抗人HDAC1多克隆抗體以及β-actin單克隆抗體）反應(yīng)過夜，隨后加入二抗反應(yīng)2小時(shí)暗室發(fā)光顯影。以Quantity One v462圖像分析軟件對圖像進(jìn)行分析，以目的條帶與β-actin灰度值的比值作為蛋白表達(dá)相對含量。

1.7細(xì)胞增殖檢測

采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔細(xì)胞數(shù)1×10⁵/孔。實(shí)驗(yàn)各組每組設(shè)5個(gè)平行孔。分別轉(zhuǎn)染各組。于轉(zhuǎn)染后（0h、24h、36h、48h、72h、96h）向每孔加入5mg/μlMTT溶液20μl。避光培養(yǎng)4小時(shí)，吸除上清液。每孔加入150μlDMSO，震蕩10分鐘，使形成的晶體充分溶解。測定570nm處吸光度（A）值，根據(jù)A值繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化

收集各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶個(gè)/mL；收集各組細(xì)胞，隨后用70%冰乙醇溶液分散固定細(xì)胞；PBS洗滌后棄上清液，加入1%Triton X-100、0.01%RNase和0.005%PI的混合液，搖勻后靜置25mm，用400目絲網(wǎng)過濾后上機(jī)分析，檢測細(xì)胞周期。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成，計(jì)算資料組間差異，采用方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用S-N-K檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Real-Time PCR結(jié)果

HDAClsiRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞36小時(shí)后，提取三組細(xì)胞的總RNA，以Real-TimePCR檢測擴(kuò)增曲線?？瞻讓φ战M、陰性對照組、siRNA轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量分別為（1.0±0.03）、（0.83±0.01）、（0.15±0.002）。與空白對照組和陰性對照組相比，siRN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞HDAC表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染HDAClsiRNA后HDAClmRNA表達(dá)水平明顯降低。

2.2 Western blotting檢測HDAC1蛋白的表達(dá)

Western bloting結(jié)果顯示：在空白對照組、陰性對照組、siRNA轉(zhuǎn)染組的三個(gè)組中，siRNA轉(zhuǎn)染組的HDAC1基因明顯下調(diào)，相比另外兩組條帶亮度明顯要弱，參照GADPH，灰度分析顯示下降了59%，而空白對照組和陰性對照組的HDACI基因無明顯變化，表明轉(zhuǎn)染的反義基因有效的下調(diào)了HDAC1，阻斷了其表達(dá)，如圖1所示。

2.3細(xì)胞增殖檢測

HDAClsiRNA瞬間轉(zhuǎn)染對乳腺癌MCF-7細(xì)胞株增殖的影響。以MTT法檢測乳腺癌MCF-7細(xì)胞株瞬間轉(zhuǎn)染HDAClsiRNA 24h、36h、48h、72h后細(xì)胞的生長情況，與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA組細(xì)胞的生長明顯變慢（P<0.05），但空白對照組與陰性對照組無明顯差異（P>0.05）。提示下調(diào)HDAC1的表達(dá)后，細(xì)胞的生長受到抑制。

2.4細(xì)胞周期檢測

轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞36小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測3組不同細(xì)胞周期的變化。如下表所示，與空白對照組與陰性對照組相比，通過RNA干擾下調(diào)HDACl的表達(dá)，細(xì)胞周期出現(xiàn)了明顯的變化，呈現(xiàn)G1、G2期阻滯、s期減少，表明通過通過RNA干擾下調(diào)HDACl的表達(dá)，有效的改變了siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期（P<0.05）。

3討論

在所有HDACs中，HDAC1與腫瘤的關(guān)系具代表性，有研究者在肺腺癌、胃癌、HL-60細(xì)胞、胰腺癌、婦科腫瘤證實(shí)RNA干擾HDAC1基因，可以下調(diào)HDAC1的表達(dá)，隨之誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制增殖。由于組蛋白乙?；惓?dǎo)致腫瘤的發(fā)生，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生異常，因此以此作為靶點(diǎn)治療是一種全新的治療途徑。

通過實(shí)驗(yàn)將HDAC1基因沉默后，可引起癌細(xì)胞有絲分裂減少，細(xì)胞凋亡增多，同時(shí)細(xì)胞的生長受到一定程度的抑制，停滯在G1或G2M期。Silvia等證明人腫瘤細(xì)胞缺乏HDACl不能進(jìn)行有絲分裂，而是通過Caspase-3激活途徑進(jìn)入凋亡，同時(shí)細(xì)胞周期停滯在G1期或G2/M過渡期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，故剔除HDAC1的表達(dá)能抑制腫瘤生長。

在乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究中，有人通過正向干預(yù)HDAC1，結(jié)果顯示組蛋白去乙醌化酶I（HDAC1）的表達(dá)可促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖。同時(shí)，構(gòu)建的反義HDACI質(zhì)粒導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞，通過下調(diào)HDAC1基因，引起了細(xì)胞的增殖抑制及周期阻滯，表明HDAC1在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中其乙酞化與去乙酸化修飾可能起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過RNA干擾的手段，下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HDAC1基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增長、使細(xì)胞周期發(fā)生改變。轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的HDAC1mRNA表達(dá)在干擾后能出現(xiàn)明顯的下降（P<0.05），HDAC基因蛋白的表達(dá)亦有明顯的下降（P<0.05），表明通過RNA干擾后能有效的阻斷了HDAC1的表達(dá)。MCF-7細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增長比空白對照組和陰性對照組增長速度明顯降低（P<0.05）。提示下調(diào)HDAC1的表達(dá)，細(xì)胞的生長受到抑制。與空白對照組與陰性對照組相比，通過RNA干擾下調(diào)HDAC1的表達(dá)，細(xì)胞周期出現(xiàn)了明顯的變化，呈現(xiàn)G1、G2期比例增高、s期比例減少，表明通過通過RNA干擾下調(diào)HDAC1的表達(dá)，有效的改變了siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期（P<0.05）。

綜上所述，HDAC1siRNA能有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞株HDAC1mRNA及蛋白的表達(dá)；在體外能有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。本研究提供了HDAC1在乳腺癌細(xì)胞中的選擇性作用譜，這為選擇性靶基因治療發(fā)展提供了新的有力的途徑。但HDAC1 siRNA抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。