補陽還五湯和星蔞承氣湯對腦缺血大鼠神經(jīng)元突觸重塑及膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子表達的影響

劉會賢劉敬霞俞維黑長春1李娟劉洋李晶晶

(寧夏醫(yī)科大學附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院，寧夏吳忠750004)

摘要〔〕目的觀察補陽還五湯和星蔞承氣湯對腦缺血大鼠神經(jīng)元突觸重塑的作用及其對膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)、突觸后致密物-95(PSD-95)表達變化的影響。方法120只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、星蔞承氣湯和補陽還五湯組；線栓法制備大腦中動脈阻塞模型；灌胃用藥并分別于14 d、28 d取材；電子透射電鏡觀察神經(jīng)元突觸變化，免疫組織化學法檢測GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF表達變化。結(jié)果與假手術(shù)組比較，14 d模型組GDNF表達明顯減弱(P<0.01)，28 d模型組GAP-43表達明顯減弱；與模型組比較，補陽還五湯14 d和28 d組 GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF表達均明顯增強(P均<0.05)，14 d星蔞承氣湯組NGF表達顯著增強(P<0.01)，28 d星蔞承氣湯組GDNF表達顯著增強(P<0.01)；與尼莫地平比較，14 d補陽還五湯組 PSD-95、NGF、GDNF表達均明顯增強(P均<0.05)，28 d補陽還五湯組PSD-95表達顯著增強(P<0.05)；與14 d比較，28 d補陽還五湯組PSD-95表達顯著增強(P<0.01)。結(jié)論補陽還五湯可明顯促進缺血后神經(jīng)元突觸重塑，其機制可能是通過上調(diào)缺血腦組織中NGF、GDNF的表達從而使GAP-43、PSD-95表達增加而實現(xiàn)。星蔞承氣湯可以上調(diào)缺血腦組織早期NGF表達而其遠期作用不明顯。

關(guān)鍵詞〔〕腦缺血；補陽還五湯；星蔞承氣湯；神經(jīng)生長因子；膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；神經(jīng)生長相關(guān)性蛋白-43；突觸后致密物-95

中圖分類號〔〕R285.5〔

基金項目：寧夏醫(yī)科大學特殊人才項目(XT200911)

通訊作者：劉敬霞(1970-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

1寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院

第一作者：劉會賢(1987-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

腦缺血后的大腦功能可塑性機理研究一直是腦科學研究的熱點，研究表明，神經(jīng)元突觸對缺血性損傷極為敏感，缺血性腦損傷會導致神經(jīng)元突觸數(shù)目、功能、結(jié)構(gòu)的變化，這種變化直接影響到神經(jīng)信息的傳遞〔1，2〕。神經(jīng)生長因子(NGF)是具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子，可以上調(diào)神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)表達，促進突觸重建，對神經(jīng)元起保護作用〔3～5〕。近年研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可以通過各種機制促進缺血后神經(jīng)元突觸重塑從而發(fā)揮腦保護作用〔6，7〕。本研究探討補陽還五湯和星蔞承氣湯對腦缺血神經(jīng)元突觸重塑的作用及機制。

1材料與試劑

1.1動物SD大鼠，普通級，120只，3～4月齡，體重(300±50)g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(寧)2011-0001。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心動物飼養(yǎng)室，以標準固型普通飼料分組喂養(yǎng)，每組12只。動物飼養(yǎng)室溫度(26±1)℃，相對濕度50%。

1.2試劑和儀器6.5%水合氯醛(寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號H20080018)。NGF(PR-0305)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF，SC-328)、GAP-43(PM-0275)、突觸后致密物(PSD)-95(PR-0286)、DAB顯色劑等，以上試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3藥物

1.3.1補陽還五湯方生黃芪120 g、歸尾6 g、地龍6 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g，生藥總量141 g；由寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)門診部藥劑科提供，方中所用生藥材去除雜質(zhì)，按組方劑量配比，加入生藥材10倍量水，浸泡60 min后用TC-15套式恒溫器250 V電壓加熱煎煮；沸騰后將電壓調(diào)低至150 V，保持微沸狀態(tài)煎煮30 min，濾取煎液；藥渣再加入生藥材8倍量的水，浸泡30 min后煎煮，保持微沸狀態(tài)煎煮30 min，濾取煎液；合并兩次煎液，將藥液于恒溫水浴鍋(100 ℃)蒸發(fā)水分至濃稠狀，濃縮至藥液含生藥2.6 g/ml，4 ℃保存?zhèn)溆茫慌R用前加蒸餾水稀釋至生藥材含量為1.3 g/ml。

1.3.2星蔞承氣湯方全瓜蔞30 g、膽南星6 g、生大黃9 g、芒硝9 g，生藥總量54 g。由寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)門診部藥劑科提供，具體煎藥方法同補陽還五湯，其中大黃后下，芒硝沖溶。將藥物濃縮至1.0 g/ml，方法同上，4 ℃保存?zhèn)溆茫慌R用前加蒸餾水稀釋至生藥材含量為0.5 g/ml。

1.3.3尼莫地平片拜耳醫(yī)藥保健有限公司提供，30 mg/片，批號：H20003010。

1.4方法

1.4.1分組與給藥SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、星蔞承氣湯組、補陽還五湯組；后四組根據(jù)術(shù)后分批取材的時間點又各分為14 d、28 d組；每組12只。所有動物于動物清醒后按相應分組開始灌胃給藥，給藥劑量按動物與人體表面積折算：補陽還五湯13.0 g·kg-1·d-1；星蔞承氣湯5.0 g·kg-1·d-1；尼莫地平10.8 mg·kg-1·d-1。每周稱重1次大鼠體重，按體重變化加減用量，模型組和假手術(shù)組以蒸餾水代替，連續(xù)灌胃14 d。

1.4.2動物模型的制備參照改良的Longa法制備局灶性腦缺血動物模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸前正中切口，左側(cè)鈍性分離頸總動脈；分離頸內(nèi)外動脈，穿線備用；于頸外動脈近動脈分叉處剪口，栓線穿入頸內(nèi)動脈，緩慢推進，直至感覺有阻力為止，穿線成功后縫合皮膚。假手術(shù)組除不穿入栓線外，其余操作相同。手術(shù)過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃，保持室溫(26±1)℃。

1.4.3 取材造模當天開始灌胃，術(shù)后連續(xù)灌胃14 d，分別于14、28 d進行神經(jīng)功能評分；麻醉大鼠，4%的多聚甲醛溶液灌注固定后斷頭取腦，于冰盤上迅速分離大腦半球，取左側(cè)半球，自額極向后至枕極剔除腦組織3 mm，向后冠狀切取腦組織1 mm，旁開3 mm切取3塊1 mm×1 mm×1 mm標本用4%戊二醛溶液固定，待做電鏡檢測；再依次向后冠狀切取2 mm厚的腦組織用4%多聚甲醛溶液固定，待做腦組織病理檢測和免疫組化指標測定。

1.4.4指標檢測

1.4.4.1電鏡標本制作將所取腦組織切成1 mm3的小塊，浸入2.5%戊二醛磷酸緩沖液(pH7.2)固定48 h。1%四氧化餓后固定1 h。丙酮逐級脫水，包埋。LKB-5超薄切片機切片，厚度為50 nm。醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色。透射式電子顯微鏡H-600照相，加速電壓80 kV。

1.4.4.2免疫組化步驟切片常規(guī)脫蠟至水；3%過氧化氫室溫避光滅活10 min，去離子水沖洗一遍，切片置于枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中微波熱修復10 min，自然冷卻至室溫；5%山羊血清室溫封閉20 min，濾紙吸干，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，室溫放置10～15 min；滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min；滴加新鮮配制的DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間，自來水終止顯色。以上各步驟間均以0.01 mol/L PBS(pH7.4)清洗5 min×3。最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照采用PBS緩沖液代替一抗，余相同。GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF均按照以上步驟進行。

1.4.4.3陽性表達觀察及測定每組取6張免疫組化切片，每張切片選取5個視野，利用奧林帕斯 DP Ctroller 3.1.1.267 圖像采集系統(tǒng)拍照，固定相機光源亮度。采用Image Pro Plus 6.0圖像全自動分析系統(tǒng)分析反映NGF、GDNF、GAP-43及PSD-95的表達。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS18.0軟件進行多因素方差分析、最小顯著差法(LSD-t)、秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗。

2結(jié)果

2.1電鏡下神經(jīng)元突觸變化假手術(shù)組細胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；模型14 d組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)破壞明顯。模型28 d組大鼠神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)改變較14 d模型組改善，細胞質(zhì)明顯水腫，細胞器數(shù)量顯著減少；線粒體水腫，嵴的數(shù)量減少，排列紊亂，部分嵴和膜融合，線粒體有致密化現(xiàn)象，部分核膜融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，游離核糖體數(shù)量明顯減少。尼莫地平14 d組神經(jīng)元周圍輕度水腫，細胞器數(shù)量減少；神經(jīng)元線粒體部分嵴和膜融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象，游離核糖體數(shù)量減少。尼莫地平28 d組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變較14 d組改善，線粒體有空化，出現(xiàn)次級溶酶體。星蔞承氣湯14 d組和28 d組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)較模型組改善，其中28 d組有脂滴和次級溶酶體出現(xiàn)。補陽還五湯14 d組線粒體輕度病變，突觸小泡聚集成堆，突觸內(nèi)線粒體輕度改變；補陽還五湯28 d組線粒體改變輕微，細胞核膜稍有不整形，突觸內(nèi)突觸小泡和線粒體的改變輕微。

2.2大鼠腦組織GAP-43變化假手術(shù)組可見棕黃色GAP-43陽性表達，與模型組比較，14 d和28 d補陽還五湯組GAP-43表達明顯增強(P<0.01，P<0.05)；與星蔞承氣湯組比較，14 d和28 d補陽還五湯組GAP-43表達明顯增強(P<0.05)；各組28 d GAP-43表達均較14 d組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠腦組織GAP-43、PSD-95、NGF及GDNF表達水平比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與尼莫地平組比較：5)P<0.05，6)P<0.01;與星蔞承氣湯組比較：7)P<0.05，8)P<0.01；與14 d組比較：9)P<0.05，10)P<0.01

2.3大鼠腦組織PSD-95變化假手術(shù)組可見棕黃色PSD-95陽性表達。與模型組及各藥物組比較，14 d和28 d補陽還五湯組PSD-95表達均明顯增強(P<0.05)，且補陽還五湯28 d組PSD-95表達較14 d組顯著增強(P<0.01)。見表1。

2.4大鼠腦組織NGF變化假手術(shù)組大鼠NGF呈棕褐色弱陽性表達。與模型組比較，14 d補陽還五湯組、星蔞承氣湯組NGF表達均顯著增強(P<0.01)，28 d尼莫地平組和28 d補陽還五湯組NGF表達顯著增強(P<0.01)；與尼莫地平組比較，14 d補陽還五湯組NGF表達顯著增強(P<0.01)；與星蔞承氣湯組比較，14 d補陽還五湯組NGF表達有升高趨勢，但未顯示統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與14 d組比較，28 d模型組及尼莫地平組NGF表達均明顯減弱(P<0.05)，28 d補陽還五湯和星蔞承氣湯組顯著減弱(P<0.01)。

2.5大鼠腦組織GDNF變化假手術(shù)組GDNF呈棕黃色，出現(xiàn)弱陽性表達。與模型組比較，14 d和28 d尼莫地平組GDNF表達明顯增強(P<0.05)，14 d和28 d補陽還五湯組及28 d星蔞承氣湯組GDNF表達均顯著增強(P<0.01)；與尼莫地平及星蔞承氣湯組比較，14 d補陽還五湯組GDNF表達顯著增強(P<0.01)；與14 d組比較，模型組、尼莫地平及補陽還五湯組GDNF表達均顯著降低(P<0.01)。

3討論

突觸結(jié)構(gòu)是大腦神經(jīng)元間進行神經(jīng)信息傳遞的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎，作為神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)單位，突觸的數(shù)量及其結(jié)構(gòu)完整性對維持大腦功能的正常發(fā)揮起到了至關(guān)重要的作用。95PSD-95是突觸后致密物質(zhì)中的一個主要蛋白，在腦組織內(nèi)廣泛分布，其在介導和整合突觸信號傳遞過程起到了重要作用〔8〕。研究表明它直接參與了缺血信號的轉(zhuǎn)導，對突觸功能和神經(jīng)元的存活具有明顯影響，PSD的改變直接影響突觸的傳遞功效〔9～11〕。GAP-43是近年來分離鑒定的一種鈣調(diào)蛋白結(jié)合胞膜磷酸蛋白，在神經(jīng)元的發(fā)育和再生過程中，GAP-43伴隨著軸突的生長大量合成，是軸突生長的一種標記物〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后神經(jīng)元突觸重塑相關(guān)蛋白的表達隨缺血時間的變化而變化，其表達與缺血損傷的程度密切相關(guān)〔13〕。腦梗死后腦內(nèi)GAP-43表達在缺血再灌注1 w時即達到高峰，2 w后開始下降且中動脈栓塞后3～14 d缺血半暗帶區(qū)GAP-43含量升高與患肢功能恢復同步進行〔14，15〕。已有的研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可以通過促進GAP-43和突觸素-1(Synapsins-1)蛋白表達而促進缺血后神經(jīng)元突觸重塑〔16〕。本研究認為，具有益氣活血通絡作用的補陽還五湯促進腦缺血損傷后神經(jīng)元突觸重塑的作用更為顯著和持久。

NGF是具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子。腦損傷時腦內(nèi)源性NGF在皮層和海馬區(qū)域的表達增加，對神經(jīng)元起保護作用〔17，18〕。GDNF是由Lin等〔19〕于1993年從大鼠膠質(zhì)細胞系B49分離純化出的一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用糖基化二硫鍵結(jié)合的同二聚體蛋白質(zhì)。體外培養(yǎng)和動物體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，GDNF對中樞和外周運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元及交感神經(jīng)元等多種神經(jīng)元也具有同等營養(yǎng)作用，在促進神經(jīng)元存活、生長、分化、神經(jīng)再生、軸突形成及軸突的可塑性等方面具有其他神經(jīng)生長因子不可替代的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的增加對神經(jīng)元突觸重塑起促進作用〔20，21〕，而中醫(yī)中藥促進缺血損傷后神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達已有大量研究〔22，23〕。本研究認為，早期應用補陽還五湯對遠期神經(jīng)元突觸重塑有促進作用，其發(fā)揮作用的機制可能是通過促進NGF、GDNF的表達，進而上調(diào)GAP-43、PSD-95水平而實現(xiàn)。星蔞承氣湯可在早期上調(diào)NGF表達而其長期作用不明顯，考慮與長期通腑邪熱導滯耗損正氣有關(guān)，中風證候多屬本虛標實，因此臨證需中病即止，扶正兼顧祛邪方可取效最佳。

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〔2013-06-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)