菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子-1表達的影響

崔秀成董志軍

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科，河北承德067000)

摘要〔〕目的探討探討菩人丹超微粉(PRD)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子(ICAM-1)表達的影響。方法36只Wistar大鼠隨機分為3組，正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組，每組12只。糖尿病模型組和PRD治療組大鼠均采用鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。模型成功建立后，PRD治療組大鼠給予PRD灌胃，時間為3個月。采用SP免疫組織化學染色法、Western印跡法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白的表達；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA的表達。結(jié)果糖尿病模型組與正常對照組比較，大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.01)，PRD治療組與糖尿病模型組比較，大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.01)。結(jié)論PRD可通過下調(diào)ICAM-1的表達，抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應，發(fā)揮對糖尿病視網(wǎng)膜損傷的保護作用。

關(guān)鍵詞〔〕菩人丹超微粉；糖尿病視網(wǎng)膜病變；細胞間黏附分子-1

中圖分類號〔〕R774.1〔

基金項目：河北省中醫(yī)藥管理局資助項目(2014066)

通訊作者：董志軍(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究。

第一作者：崔秀成(1964-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事糖尿病眼病研究。

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導致不可逆性盲的重要原因之一〔1，2〕。研究表明〔3〕，細胞間黏附分子(ICAM)-1介導的炎癥反應在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抑制眼內(nèi)ICAM-1失衡是DR防治的重要靶方向。菩人丹超微粉(PRD)針對糖尿病病機關(guān)鍵“熱、虛、瘀”，依據(jù)傳統(tǒng)方，并結(jié)合臨床研究及現(xiàn)代藥理學研究成果，確立以苦瓜為君藥，人參、丹參為臣藥，葛根、何首烏、水蛭為佐使藥的菩人丹中藥組方。諸藥協(xié)同，益氣養(yǎng)陰，調(diào)暢氣血，化瘀通絡(luò)?，F(xiàn)代藥理研究證實PRD具有抑制氧化應激、對抗細胞凋亡和衰老、改善微循環(huán)、促進組織修復與再生等作用〔4〕。前期研究證實：PRD能有效修復2型糖尿病大鼠損傷的胰島β細胞、降低血糖，并具有保護糖尿病并發(fā)的大血管、微血管病變等作用〔4，5〕。本文旨在通過觀察PRD對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1表達的影響，探討PRD對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥病變的保護作用。

1材料與方法

1.1藥物與試劑PRD由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根、水蛭按10∶1∶3∶1∶1∶0.3的比例組方提取而成，每1 g超微粉相當于8～15 g生藥，由中央民族大學中國少數(shù)民族醫(yī)學研究院提供；鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司；Trizol，美國Invitrogen公司；ICAM-1兔抗多克隆抗體，武漢博士德生物工程公司；ICAM-1引物，上海生工公司；SP免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)公司；蛋白定量試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.2實驗動物清潔級雄性Wistar大鼠〔北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK(京)2006～0009〕，體質(zhì)量200～250 g。動物的飼養(yǎng)和實驗過程遵循中國科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.3動物模型制備及分組將36只大鼠應用隨機數(shù)字表法進行完全隨機化分組，分為正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組，每組12只。糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均采用質(zhì)量分數(shù)2% STZ(25 mg·kg-1·d-1)腹腔注射建立糖尿病動物模型，每日注射1次，連續(xù)3 d，以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標準〔6〕。模型成功建立后，模型組大鼠不做任何處理；按體表面積折算確定PRD治療組大鼠給藥劑量為每日1.8 g/kg，連續(xù)灌胃3個月。

1.4標本制備給藥結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 g/kg)大鼠，迅速取出雙側(cè)眼球。一側(cè)眼球浸于4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，備用于免疫組織化學染色；另一側(cè)眼球迅速在動物手術(shù)顯微鏡下冰面上鈍性分E離視網(wǎng)膜，投入液氮中保存，分別備用于Western印跡及RT-PCR檢測。

1.5免疫組織化學染色檢測ICAM-1蛋白的表達眼球平行視神經(jīng)連續(xù)矢狀切片，片厚4 μm，采用SP免疫組織化學染色法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達。 一抗稀釋濃度均為1∶100，DAB顯色，蘇木素復染細胞核。以0.01 mmol/L PBS代替一抗作為陰性對照，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。

1.6Western印跡檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白的表達取液氮中保存的視網(wǎng)膜組織，提取蛋白質(zhì)，以BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，12% SDS-PAGE凝膠電泳，80～120 V、2 h，電泳完畢后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；5% 脫脂奶粉TBST封閉2 h；加入1∶200稀釋的ICAM-1抗體，4℃過夜；洗膜后用1∶5 000稀釋的二抗辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)物室溫搖床孵育1 h；Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantity One-4.6.2軟件對顯影條帶進行分析，以ICAM-1條帶與β-actin條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.7RT-PCR法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1 nRNA表達視網(wǎng)膜組織，在液氮中碾磨成粉末，按Trizol總RNA抽提說明書操作，提取視網(wǎng)膜組織的總RNA。取5 μl RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的28 s、18 s和5 s三條完整的條帶，說明抽提的總RNA比較完整；紫外分光光度計檢測OD260/OD280值為1.9～2.1，說明RNA沒有被污染。取3 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應條件為：30℃，10 min；55℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5min。PCR反應條件：94℃，2 min；94℃，30 s；50℃～65℃，30 s；72℃，1 min，第二步起循環(huán)。ICAM-1引物序列為：正義鏈：5’ ACCCACCTCACAGGGTACTTC 3’，反義鏈：5’ GAGTCTGCTGAGACCCCTCTT 3’，退火溫度為60℃，29個循環(huán)，產(chǎn)物大小為233 bp；β-actin引物序列為：正義鏈:：5’CATCCTGCGTCTGGACCT 3’，反義鏈：5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’，退火溫度為58℃，29個循環(huán)，產(chǎn)物大小為480 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像，并用Quantity One-4.6.2軟件進行定量分析，以目的條帶的光密度與β-actin條帶光密度的比值，作為ICAM-1 mRNA表達的相對水平。

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學檢測結(jié)果ICAM-1免疫陽性產(chǎn)物位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，免疫陽性細胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層。糖尿病模型組ICAM-1陽性產(chǎn)物表達明顯強于正常組，胞漿呈深棕黃色；PRD治療后，ICAM-1陽性產(chǎn)物表達較模型組減弱，胞質(zhì)呈棕黃色。

2.2Western印跡法檢測結(jié)果在蛋白Marker的97 kD、43 kD水平處，分別可見ICAM-1的蛋白條帶及β-actin條帶。糖尿病模型組與正常對照組比較，大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達明顯升高(P<0.01)；PRD治療組與糖尿病模型組比較，大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.3RT-PCR檢測結(jié)果在DNA Marker的233 bp、480 bp水平處分別可見清晰的ICAM-1及β-actin mRNA條帶。糖尿病模型組與正常對照組比較，大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA表達明顯升高(P<0.01)；PRD治療組與糖尿病模型組比較，大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及

與糖尿病模型組比較：1)P<0.01

3討論

視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的損害是DR的重要特征，血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)功能障礙和視網(wǎng)膜新生血管形成是DR的主要病理改變，是導致DR患者視力損害的主要血管性因素〔7〕。近年的觀點認為DR是一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病，炎癥因子過度表達介導的炎癥反應在糖尿病視網(wǎng)膜微血管損傷中起到了關(guān)鍵作用，特別是ICAM-1被認為是與DR聯(lián)系緊密的炎癥因子〔8〕。

ICAM-1是一種對免疫反應、炎癥反應有重要調(diào)節(jié)和介導作用的炎癥因子〔9〕。正常生理情況下，低濃度的ICAM-1及其配體在維持正常組織結(jié)構(gòu)，參與細胞凋亡、增殖過程中起重要作用。Zhu等〔10〕研究表明，在STZ致糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜組織中的ICAM-1表達異常升高，應用ICAM-1抑制劑后可以改善高血糖時視網(wǎng)膜炎性病變，提示ICAM-1在DR微血管病變過程中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白和mRNA的表達均明顯增高。糖尿病時慢性高血糖可引起代謝發(fā)生異常，導致視網(wǎng)膜毛細血管結(jié)構(gòu)和功能破壞，引起視網(wǎng)膜血流動力學改變，視網(wǎng)膜處于缺血、缺氧狀態(tài)，細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，導致視網(wǎng)膜氧化應激、局部炎癥反應增強，進而誘導強有力的炎癥分子ICAM-1表達異常升高，高表達的ICAM-1使白細胞淤滯，白細胞黏附可引起視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞的凋亡，激活血小板，導致血流緩慢和血栓形成、毛細血管無灌注的形成及血視網(wǎng)膜屏障破壞，從而促進DR的發(fā)生發(fā)展〔8〕。

本研究表明PRD可通過下調(diào)視網(wǎng)膜組織ICAM-1的表達，減少視網(wǎng)膜微血管滲漏及病理性新生血管生成，發(fā)揮對糖尿病視網(wǎng)膜微血管損傷的保護作用。由于PRD可發(fā)揮中藥組方多環(huán)節(jié)、多靶位的治療優(yōu)勢，且對人體無毒性，避免了化學合成藥物帶給人體的不良反應，因此可能為DR治療提供新的方法。

4參考文獻

1Zhang W，Liu H，Al-Shabrawey M，etal.Inflammation and diabetic retinal microvascular complications〔J〕.J Cardiovasc Dis Res，2011;2(2):96-103.

2Mahdy RA，Nada WM.Evaluation of the role of vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy〔J〕.Ophthalmic Res，2011;45(2):87-91.

3Wu CF，Xue JR，Lang P.Effects of melatonin on oxidative stress and the expression of ICAM-1 on retina in diabetic rat〔J〕.Chin Ophthal Res，2010;28(4)：330-3.

4龐宗然，趙玉堂，李靜華，等.菩人丹超微粉對肥胖型2型糖尿病大鼠糖代謝相關(guān)指標的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2010；16 (5)：107-10.

5龐宗然，劉祖涵，蘇曉惠，等.菩人丹超微粉對肥胖型T2DM大血管損傷大鼠ET-1、NO、FFAs含量的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(10):1779-80.

6向雪松，王竹祝，宇銘，等.鏈脲佐菌素注射劑量對建立2型糖尿病大鼠模型的影響〔J〕.衛(wèi)生研究，2010；39(2)：138-42.

7Pelzek C，Lim JI.Diabetic macular edema：review and update〔J〕.Ophthalmol Clin North Am，2002;15(4)：555-63.

8Zhang XL，Wen L，Chen YJ，etal.Vascular endothelial growth factor up-regulates the expression of intracellular adhesion molecule-1 in retinal endothelial cells via reactive oxygen species，but not nitric oxide〔J〕.Chin Med J(Engl)，2009;122(3)：338-43.

9Kim YS，Park GB，Song HK，etal.Cross-linking of cd54 on Burkitt lymphoma cell line Raji and Ramos induces FasL expression by reactive oxygen species and apoptosis of adjacent cells in Fas/FasL interaction〔J〕.Immunotberapy，2007;30(7)：727-39.

10Zhu Y，Zhang XL，Zhu BF，etal.Effect of antioxidant N-acetylcysteine on diabetic retinopathy and expression of VEGF and ICAM-1 from retinal blood vessels of diabetic rats〔J〕.Mol Biol Rep，2011;28(9)：〔Epub ahead of print〕.

〔2013-08-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)