吳強(qiáng) 張祥海
[摘要]目的 本研究旨在探討CDl47和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)水平與臨床病理之間的聯(lián)系以及相互關(guān)系。方法運(yùn)用免疫組化的方法對(duì)57例肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行CDl47和VEGF-C檢測(cè)。結(jié)果(1)57例肺鱗癌、腺癌中CDl47和VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.16%、66.67%。肺鱗癌組和腺癌組CDl47和VEGF-C表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。(2)肺鱗癌、腺癌中CDl47和VEGF-C表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)及腫瘤TNM分期有關(guān)(P<0.01),而與患者的年齡、性別、吸煙及腫瘤細(xì)胞分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。(3)CDl47與VEGF—C的表達(dá)呈正相關(guān)(x2=12.214,P<0.01)。結(jié)論 CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌的浸潤(rùn)進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用,而且可能發(fā)揮協(xié)同作用。CD147和VEGF-C可作為判斷肺癌患者預(yù)后的有用指標(biāo)。
[關(guān)鍵詞]肺腫瘤;免疫組化;CD147;VEGF-C
[中圖分類(lèi)號(hào)]R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B [文章編號(hào)]2095-0616(2016)06-156-05
CDl47是一種廣泛分布于人體多種組織細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白,又名為細(xì)胞外基質(zhì)金屬酶誘導(dǎo)蛋白(EMMPRN),屬于免疫球蛋白家族(IgSF)成員。它在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),刺激腫瘤中的成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)蛋白酶類(lèi)(MMPs),參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解,在腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。VEGF-C是VEGF家族成員,具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用,VEGF-C的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成及腫瘤細(xì)胞向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)57例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中CDl47和VEGF-C的表達(dá)情況,探討其與肺癌組織的組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間的關(guān)系及二者的相關(guān)性。
1.材料與方法
1.1病理標(biāo)本
收集三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(宜昌市中心人民醫(yī)院)胸心外科2003年7月-2007年4月手術(shù)切除且術(shù)前未經(jīng)放化療的原發(fā)性肺鱗癌、腺癌組織標(biāo)本57例。所有標(biāo)本均常規(guī)取材,甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,厚度5um連續(xù)切片。分別做HE和免疫組化染色。
1.2臨床與病理資料
本組共57例患者均經(jīng)臨床病理確診,術(shù)前均未經(jīng)放療或化療治療,其中男46例,女11例;年齡28~71歲,平均57.3歲,鱗癌46例,腺癌11例;手術(shù)切除淋巴結(jié)病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例,病理分級(jí):高分化16例,中分化24例,低分化17例。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)2002年頒布的第6版國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期,I(Ia+Ib)期13例,Ⅱ期(Ⅱa+Ⅱb)26例,Ⅲ(Ⅲa+Ⅲb)期13例,Ⅳ期5例,吸煙(吸煙指數(shù)>400)34例。
1.3試劑
兔抗人CDl47多克隆抗體,兔抗人VEGF-C多克隆抗體及PV-9000二步法即用型試劑盒均從北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)。
1.4方法
免疫組化染色采用PV-9000二步法,按照說(shuō)明書(shū)操作步驟如下:(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化。(2)用3%H2O2去離子水孵育10min,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。(3)根據(jù)一抗要求用微波加熱抗原修復(fù)。(4)滴加一抗,濕盒中37℃兩小時(shí),PBS沖洗,2min×3次。(5)滴加試劑1,室溫孵育20min,PBS沖洗2min×3次。(6)滴加試劑2,室溫孵育30min,PBS沖洗2min×3次。(7)用DAB溶液顯色。(8)蘇木精復(fù)染后,脫水,透明,封片。用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照,用已知陽(yáng)性對(duì)照片作陽(yáng)性對(duì)照。
1.5CD147和VEGF-C結(jié)果判定
CDl47以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)呈黃色為陽(yáng)性,VEGF-C陽(yáng)性染色主要為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(400倍),每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。CDl47綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色細(xì)胞占癌細(xì)胞總數(shù)的比例進(jìn)行判斷。(1)按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分:0分細(xì)胞無(wú)著色;1分為黃色;2分棕黃色;3分為棕褐色。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占癌細(xì)胞總數(shù)的比例評(píng)分:1分為<25%;2分為≥25%且≤50%;3分為>50%且≤75%;4分為>75%。取(1)、(2)兩項(xiàng)的乘積為總積分:0~3分為陰性;>3分且≤6分為(+);>6分且≤9分為(++);>9分為(+++)。VEGF-C陽(yáng)性強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn):癌細(xì)胞,脈管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為染色陽(yáng)性細(xì)胞。肺癌細(xì)胞VEGF-C表達(dá)強(qiáng)度:按癌細(xì)胞免疫組化染色著色深淺計(jì)分:0分為無(wú)色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比打分:陰性為0分、陽(yáng)性細(xì)胞<10%為1分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%~50%為2分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>51%為3分;染色強(qiáng)度與-陽(yáng)性細(xì)胞分比的乘積:0~2分為,3~4分為+、5~7分++、8~9分+++。染色結(jié)果有兩名病理醫(yī)師采用雙盲法評(píng)定,(-/+)為低表達(dá),(++/+++)為高表達(dá)。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)和相關(guān)分析,并計(jì)算Pearson列聯(lián)系數(shù),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.結(jié)果
2.1CDl47與VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)及與病理特征的關(guān)系
免疫組化染色CD147主要定位于腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi),VEGF-C主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),均呈棕黃色或褐色小片狀或顆粒狀。在本組病例中CDl47與VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.16%(36/57)、66.67%(38/57),CDl47在肺鱗癌、腺癌的陽(yáng)性率分別為58.70%(27/46)、81.82%(9/11),VEGF-C在肺鱗癌、腺癌的陽(yáng)性率分別為60.87%(28/46)、90.91%(10/11),二者在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在不同的細(xì)胞分化程度之間CDl47和VEGF-C的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CDl47和VEGF-C在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率分別為(24/29)82.76%、82.76%(24/29),顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組42.86%(12/28)、50.00%(14/28)(P<0.05)。見(jiàn)表1。
2.2CD147與VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系
CD147和VEGF-C在肺癌中的陽(yáng)性表達(dá)與患者的年齡、性別及有無(wú)吸煙(吸煙指數(shù)>400)均無(wú)明顯地相關(guān)性。在I+Ⅱ期組CDl47和VEGF-C的陽(yáng)性率分別為48.72%(19/39)、53.85%(21/39);在Ⅲ+Ⅳ期組分別為94.44%(17/18)、94.44%(17/18)。CDl47和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)與腫瘤的臨床分期有密切關(guān)系(P<0.01)。見(jiàn)表2。
2.3CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)的相互關(guān)系
57例患者中,36例CDl47陽(yáng)性表達(dá)中同時(shí)有VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)30例;21例CDl47陰性患者中,有8例VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)。CDl47與VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)(X2=12.214,P<0.01)。見(jiàn)表3。
3.討論
肺癌與其他實(shí)體腫瘤一樣具有侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性,而惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是多因素參與的交聯(lián)式多步驟反應(yīng)的復(fù)雜過(guò)程。包括原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)、基底膜降解、腫瘤細(xì)胞進(jìn)出血管和腫瘤細(xì)胞對(duì)靶組織侵襲等環(huán)節(jié)。在這一復(fù)雜的過(guò)程中,細(xì)胞外基質(zhì)的降解、腫瘤血管及淋巴管的生成對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。近年來(lái)對(duì)CDl47與腫瘤的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),CDl47廣泛表達(dá)于人體多種細(xì)胞,在膀胱癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、淋巴瘤,結(jié)直腸癌,子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加。CDl47可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子而對(duì)腫瘤的血管生成有促進(jìn)作用,也可以刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP2、MMP9等),其通過(guò)水解Ⅳ型膠原破壞腫瘤細(xì)胞周?chē)幕啄ず驼{(diào)節(jié)VEGF而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Zheng等在對(duì)胃癌的研究中發(fā)現(xiàn),CD147表達(dá)增強(qiáng)具有促進(jìn)血管生成及VEGF表達(dá)的作用。黎明等在對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn),多數(shù)患者都存在CD147和VEGF共同表達(dá),且兩者呈正相關(guān)(r=0.406,P<0.01)。Tang等在共培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中,CD147過(guò)表達(dá)時(shí)VEGF的表達(dá)上調(diào);抑制CD147的表達(dá)、中和CD147蛋白的活性或抑制MMP的活性,都會(huì)使VEGF的表達(dá)受到抑制。Tang等還對(duì)VEGF產(chǎn)生過(guò)程中可能的信號(hào)通路如P13K-Akt、MAPK、JUN、p38激酶進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中,過(guò)表達(dá)的CDl47只能刺激Akt和MAPK的磷酸化,而不能刺激JUN和p38激酶的磷酸化。而抑制CDl47的表達(dá)會(huì)抑制Akt和MAPK的磷酸化。這些結(jié)果表明在腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中,CDl47是通過(guò)P13K-Akt途徑調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)。
VEGF-C是VEGF家族成員之一,是特異的促淋巴管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和腫瘤血管生成標(biāo)志物,在促進(jìn)腫瘤淋巴管和血管生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移起重要作用。其受體有VEGFR-2(FLK-1)和VGEFR-3(fit-4)。VEGF-C對(duì)VEGFR-3(fit-4)有更高的親和力,與之優(yōu)先結(jié)合,VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后通過(guò)MEK/ERK和P13K-Akt途徑引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生,VEGF-C蛋白水解后的成熟形式還可結(jié)合并激活VEGFR-2,作用于血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。近年來(lái)許多研究表明多種人類(lèi)腫瘤表達(dá)VEGF-C,大部分中VEGF-C表達(dá)上調(diào),且與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)CDl47在57例肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示CDl47和VEGF-C在肺鱗癌和腺癌中高表達(dá),陽(yáng)性率分別為58.70%(27/46)、81.82%(9/11)和60.87%(28/46)、90.91%(10/11),二者之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CDl47和VEGF-C在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率分別為82.76%(24/29)、82.76%(24/29),顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組42.86%(12/28)、50.00%(14/28)(P<0.05);TNM分期Ⅲ+Ⅳ期組的陽(yáng)性率分別為94.44%(17/18)、94.44%(17/18)顯著高于I+Ⅱ期組的48.72%(19/39)、53.85%(21/39)。CDl47和VEGF-C的高表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān),而與患者年齡、性別、吸煙等臨床因素及腫瘤組織類(lèi)型、細(xì)胞分化程度無(wú)明顯的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者和腫瘤后期的患者CDl47和VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高,說(shuō)明CDl47和VEGF-C與肺鱗癌、腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力正相關(guān)。與王莉等對(duì)CDl47的研究及陳蘇娟等對(duì)VEGF-C的研究結(jié)果一致。
目前國(guó)內(nèi)對(duì)CDl47和VEGF-C的相互作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。黎明等在對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn),多數(shù)患者都存在CD147和VEGF共同表達(dá),且兩者呈正相關(guān)。Tang等試驗(yàn)表明,CDl47通過(guò)P13K-AKT途徑調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá),從而加速腫瘤血管的生成。VEGF-C是VEGF家族成員之一,可以調(diào)節(jié)腫瘤血管及淋巴管的生成,其主要作用是促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成。在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌、腺癌中出現(xiàn)CDl47和VEGF-C聯(lián)合表達(dá)的比例較高,在36例CDl47陽(yáng)性的病例中有30例VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性,二者表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)(P<0.01)。提示CDl47和VEGF-C這兩種蛋白在肺鱗癌、腺癌中可能發(fā)揮協(xié)同作用,CDl47也可能上調(diào)VEGF-C的表達(dá),促進(jìn)腫瘤淋巴管的生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
綜上所述,CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,CD147和VEGF-C即可以作為獨(dú)立因素也可能相互協(xié)同促進(jìn)肺鱗癌、腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移,二者均可作為判斷肺癌預(yù)后的參考指標(biāo)。