吳強(qiáng)　張祥海

[摘要]目的 本研究旨在探討CDl47和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)水平與臨床病理之間的聯(lián)系以及相互關(guān)系。方法運(yùn)用免疫組化的方法對(duì)57例肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行CDl47和VEGF-C檢測(cè)。結(jié)果（1）57例肺鱗癌、腺癌中CDl47和VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.16%、66.67%。肺鱗癌組和腺癌組CDl47和VEGF-C表達(dá)無(wú)差異（P>0.05）。（2）肺鱗癌、腺癌中CDl47和VEGF-C表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）及腫瘤TNM分期有關(guān)（P<0.01），而與患者的年齡、性別、吸煙及腫瘤細(xì)胞分化程度無(wú)關(guān)（P>0.05）。（3）CDl47與VEGF—C的表達(dá)呈正相關(guān)（x2=12.214，P<0.01）。結(jié)論 CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌的浸潤(rùn)進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用，而且可能發(fā)揮協(xié)同作用。CD147和VEGF-C可作為判斷肺癌患者預(yù)后的有用指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]肺腫瘤；免疫組化；CD147；VEGF-C

[中圖分類(lèi)號(hào)]R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B [文章編號(hào)]2095-0616（2016）06-156-05

CDl47是一種廣泛分布于人體多種組織細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，又名為細(xì)胞外基質(zhì)金屬酶誘導(dǎo)蛋白（EMMPRN），屬于免疫球蛋白家族（IgSF）成員。它在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，刺激腫瘤中的成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)蛋白酶類(lèi)（MMPs），參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解，在腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。VEGF-C是VEGF家族成員，具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用，VEGF-C的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成及腫瘤細(xì)胞向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)57例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中CDl47和VEGF-C的表達(dá)情況，探討其與肺癌組織的組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間的關(guān)系及二者的相關(guān)性。

1.材料與方法

1.1病理標(biāo)本

收集三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（宜昌市中心人民醫(yī)院）胸心外科2003年7月-2007年4月手術(shù)切除且術(shù)前未經(jīng)放化療的原發(fā)性肺鱗癌、腺癌組織標(biāo)本57例。所有標(biāo)本均常規(guī)取材，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，厚度5um連續(xù)切片。分別做HE和免疫組化染色。

1.2臨床與病理資料

本組共57例患者均經(jīng)臨床病理確診，術(shù)前均未經(jīng)放療或化療治療，其中男46例，女11例；年齡28～71歲，平均57.3歲，鱗癌46例，腺癌11例；手術(shù)切除淋巴結(jié)病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，病理分級(jí)：高分化16例，中分化24例，低分化17例。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002年頒布的第6版國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，I（Ia+Ib）期13例，Ⅱ期（Ⅱa+Ⅱb）26例，Ⅲ（Ⅲa+Ⅲb）期13例，Ⅳ期5例，吸煙（吸煙指數(shù)>400）34例。

1.3試劑

兔抗人CDl47多克隆抗體，兔抗人VEGF-C多克隆抗體及PV-9000二步法即用型試劑盒均從北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)。

1.4方法

免疫組化染色采用PV-9000二步法，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟如下：（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化。（2）用3%H2O2去離子水孵育10min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。（3）根據(jù)一抗要求用微波加熱抗原修復(fù)。（4）滴加一抗，濕盒中37℃兩小時(shí)，PBS沖洗，2min×3次。（5）滴加試劑1，室溫孵育20min，PBS沖洗2min×3次。（6）滴加試劑2，室溫孵育30min，PBS沖洗2min×3次。（7）用DAB溶液顯色。（8）蘇木精復(fù)染后，脫水，透明，封片。用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性對(duì)照片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.5CD147和VEGF-C結(jié)果判定

CDl47以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)呈黃色為陽(yáng)性，VEGF-C陽(yáng)性染色主要為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（400倍），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。CDl47綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色細(xì)胞占癌細(xì)胞總數(shù)的比例進(jìn)行判斷。（1）按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分：0分細(xì)胞無(wú)著色；1分為黃色；2分棕黃色；3分為棕褐色。（2）按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占癌細(xì)胞總數(shù)的比例評(píng)分：1分為<25%；2分為≥25%且≤50%；3分為>50%且≤75%；4分為>75%。取（1）、（2）兩項(xiàng)的乘積為總積分：0～3分為陰性；>3分且≤6分為（+）；>6分且≤9分為（++）；>9分為（+++）。VEGF-C陽(yáng)性強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)：癌細(xì)胞，脈管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為染色陽(yáng)性細(xì)胞。肺癌細(xì)胞VEGF-C表達(dá)強(qiáng)度：按癌細(xì)胞免疫組化染色著色深淺計(jì)分：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比打分：陰性為0分、陽(yáng)性細(xì)胞<10%為1分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～50%為2分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>51%為3分；染色強(qiáng)度與-陽(yáng)性細(xì)胞分比的乘積：0～2分為，3～4分為+、5～7分++、8～9分+++。染色結(jié)果有兩名病理醫(yī)師采用雙盲法評(píng)定，（-/+）為低表達(dá)，（++/+++）為高表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)和相關(guān)分析，并計(jì)算Pearson列聯(lián)系數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1CDl47與VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)及與病理特征的關(guān)系

免疫組化染色CD147主要定位于腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，VEGF-C主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色或褐色小片狀或顆粒狀。在本組病例中CDl47與VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.16%（36/57）、66.67%（38/57），CDl47在肺鱗癌、腺癌的陽(yáng)性率分別為58.70%（27/46）、81.82%（9/11），VEGF-C在肺鱗癌、腺癌的陽(yáng)性率分別為60.87%（28/46）、90.91%（10/11），二者在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在不同的細(xì)胞分化程度之間CDl47和VEGF-C的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CDl47和VEGF-C在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率分別為（24/29）82.76%、82.76%（24/29），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組42.86%（12/28）、50.00%（14/28）（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2CD147與VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

CD147和VEGF-C在肺癌中的陽(yáng)性表達(dá)與患者的年齡、性別及有無(wú)吸煙（吸煙指數(shù)>400）均無(wú)明顯地相關(guān)性。在I+Ⅱ期組CDl47和VEGF-C的陽(yáng)性率分別為48.72%（19/39）、53.85%（21/39）；在Ⅲ+Ⅳ期組分別為94.44%（17/18）、94.44%（17/18）。CDl47和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)與腫瘤的臨床分期有密切關(guān)系（P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.3CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)的相互關(guān)系

57例患者中，36例CDl47陽(yáng)性表達(dá)中同時(shí)有VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)30例；21例CDl47陰性患者中，有8例VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)。CDl47與VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)（X2=12.214，P<0.01）。見(jiàn)表3。

3.討論

肺癌與其他實(shí)體腫瘤一樣具有侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，而惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是多因素參與的交聯(lián)式多步驟反應(yīng)的復(fù)雜過(guò)程。包括原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)、基底膜降解、腫瘤細(xì)胞進(jìn)出血管和腫瘤細(xì)胞對(duì)靶組織侵襲等環(huán)節(jié)。在這一復(fù)雜的過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)的降解、腫瘤血管及淋巴管的生成對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。近年來(lái)對(duì)CDl47與腫瘤的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，CDl47廣泛表達(dá)于人體多種細(xì)胞，在膀胱癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、淋巴瘤，結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加。CDl47可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子而對(duì)腫瘤的血管生成有促進(jìn)作用，也可以刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生金屬基質(zhì)蛋白酶（MMP2、MMP9等），其通過(guò)水解Ⅳ型膠原破壞腫瘤細(xì)胞周?chē)幕啄ず驼{(diào)節(jié)VEGF而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Zheng等在對(duì)胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD147表達(dá)增強(qiáng)具有促進(jìn)血管生成及VEGF表達(dá)的作用。黎明等在對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者都存在CD147和VEGF共同表達(dá)，且兩者呈正相關(guān)（r=0.406，P<0.01）。Tang等在共培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，CD147過(guò)表達(dá)時(shí)VEGF的表達(dá)上調(diào)；抑制CD147的表達(dá)、中和CD147蛋白的活性或抑制MMP的活性，都會(huì)使VEGF的表達(dá)受到抑制。Tang等還對(duì)VEGF產(chǎn)生過(guò)程中可能的信號(hào)通路如P13K-Akt、MAPK、JUN、p38激酶進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)的CDl47只能刺激Akt和MAPK的磷酸化，而不能刺激JUN和p38激酶的磷酸化。而抑制CDl47的表達(dá)會(huì)抑制Akt和MAPK的磷酸化。這些結(jié)果表明在腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，CDl47是通過(guò)P13K-Akt途徑調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)。

VEGF-C是VEGF家族成員之一，是特異的促淋巴管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和腫瘤血管生成標(biāo)志物，在促進(jìn)腫瘤淋巴管和血管生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移起重要作用。其受體有VEGFR-2（FLK-1）和VGEFR-3（fit-4）。VEGF-C對(duì)VEGFR-3（fit-4）有更高的親和力，與之優(yōu)先結(jié)合，VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后通過(guò)MEK/ERK和P13K-Akt途徑引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生，VEGF-C蛋白水解后的成熟形式還可結(jié)合并激活VEGFR-2，作用于血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。近年來(lái)許多研究表明多種人類(lèi)腫瘤表達(dá)VEGF-C，大部分中VEGF-C表達(dá)上調(diào)，且與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)CDl47在57例肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示CDl47和VEGF-C在肺鱗癌和腺癌中高表達(dá)，陽(yáng)性率分別為58.70%（27/46）、81.82%（9/11）和60.87%（28/46）、90.91%（10/11），二者之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CDl47和VEGF-C在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率分別為82.76%（24/29）、82.76%（24/29），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組42.86%（12/28）、50.00%（14/28）（P<0.05）；TNM分期Ⅲ+Ⅳ期組的陽(yáng)性率分別為94.44%（17/18）、94.44%（17/18）顯著高于I+Ⅱ期組的48.72%（19/39）、53.85%（21/39）。CDl47和VEGF-C的高表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，而與患者年齡、性別、吸煙等臨床因素及腫瘤組織類(lèi)型、細(xì)胞分化程度無(wú)明顯的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者和腫瘤后期的患者CDl47和VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，說(shuō)明CDl47和VEGF-C與肺鱗癌、腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力正相關(guān)。與王莉等對(duì)CDl47的研究及陳蘇娟等對(duì)VEGF-C的研究結(jié)果一致。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)CDl47和VEGF-C的相互作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。黎明等在對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者都存在CD147和VEGF共同表達(dá)，且兩者呈正相關(guān)。Tang等試驗(yàn)表明，CDl47通過(guò)P13K-AKT途徑調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，從而加速腫瘤血管的生成。VEGF-C是VEGF家族成員之一，可以調(diào)節(jié)腫瘤血管及淋巴管的生成，其主要作用是促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌、腺癌中出現(xiàn)CDl47和VEGF-C聯(lián)合表達(dá)的比例較高，在36例CDl47陽(yáng)性的病例中有30例VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性，二者表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)（P<0.01）。提示CDl47和VEGF-C這兩種蛋白在肺鱗癌、腺癌中可能發(fā)揮協(xié)同作用，CDl47也可能上調(diào)VEGF-C的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤淋巴管的生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，CD147和VEGF-C即可以作為獨(dú)立因素也可能相互協(xié)同促進(jìn)肺鱗癌、腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，二者均可作為判斷肺癌預(yù)后的參考指標(biāo)。