摘要［目的］探究不同內(nèi)生菌群落對鎘（Cd）脅迫的響應(yīng)以及對宿主Cd積累的影響。［方法］以刺兒菜內(nèi)生菌為研究對象，通過土壤滅菌重塑其群落結(jié)構(gòu)，利用16SrDNA基因高通量測序明確Cd脅迫下不同刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化及其對刺兒菜富集特性的影響。［結(jié)果］內(nèi)生菌重塑（ST）處理明顯改變了內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)，增加了內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性。Cd脅迫下一些能夠促進植物生長的細(xì)菌，如鞘氨醇單胞菌屬、德沃斯氏菌屬成為優(yōu)勢類群。Cd脅迫處理中刺兒菜的生物量顯著高于對照組，其中根、葉生物量在Cd脅迫下顯著增加（Plt;0.05）。內(nèi)生菌重塑（ST）處理顯著提高刺兒菜Cd含量與Cd累積量（Plt;0.05）。［結(jié)論］刺兒菜植株內(nèi)不同內(nèi)生細(xì)菌群落對Cd脅迫的響應(yīng)不同，并影響著刺兒菜對Cd的富集能力。

關(guān)鍵詞刺兒菜；鎘脅迫；內(nèi)生細(xì)菌；多樣性

中圖分類號X171"文獻(xiàn)標(biāo)識碼A"文章編號0517-6611（2024）24-0059-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.014

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

ResponseofEndophyticBacterialDiversityinCirsiumarvensetoCadmiumStress

LIUJia-li1，LIMing-fei1，WUQuan-wei2etal

（1.SchoolofLifeSciencesandEngineering，ShenyangUniversity，Shenyang，Liaoning110044;2.GuonengNingxiaLingwuPowerGenerationCo.，Ltd.，Lingwu，Ningxia751400）

Abstract［Objective］Toexploretheresponseofdifferentendophyticbacterialcommunitiestocadmium（Cd）stressandtheirimpactonhostCdaccumulation.［Method］TakingtheendophyticbacteriaofC.arvenseastheresearchobject，thecommunitystructurewasreshapedthroughsoilsterilization，andhigh-throughput16SrDNAgenesequencingwasusedtoclarifythechangesinthecommunitystructureofdifferentendophyticbacteriaofC.arvenseunderCdstressanditsimpactontheenrichmentcharacteristicsofC.arvense.［Result］Endophyticreshaping（ST）treatmentsignificantlychangedthestructureofendophyticbacterialcommunitiesandsignificantlyincreasedtheirdiversity.UnderCdstress，somebacteriathatcouldpromoteplantgrowth，suchasSphingomonasandDevosiabecamedominantgroups.ThebiomassofC.arvenseincadmiumstresstreatmentwassignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup，withasignificantincreaseinrootandleafbiomassunderCdstress（Plt;0.05）.Thereshapingofendophyticbacteria（ST）significantlyincreasedthecadmiumcontentandaccumulationinC.arvense（Plt;0.05）.［Conclusion］DifferentendophyticbacterialcommunitieswithintheC.arvenseplanthavedifferentresponsestoCdstressandaffectitsabilitytoaccumulateCd.

KeywordsCirsiumarvense;Cdstress;Endophyticbacteria;Diversity

重金屬鎘在土壤與植物中有較高的遷移率，不僅影響植物發(fā)育、降低作物品質(zhì)與產(chǎn)量，甚至可以通過食物鏈進入人體，嚴(yán)重危害人類健康^［1］。土壤重金屬修復(fù)已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點問題。與傳統(tǒng)的修復(fù)方法對比，植物修復(fù)具有良好的前景，利用富集或超富集植物提取、鈍化或轉(zhuǎn)化土壤中重金屬。然而，富集植物受區(qū)域氣候、環(huán)境因子以及污染物毒害等因素的影響，迫使植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用受限。增強植物對重金屬的耐受性以及促進其對Cd的吸收與轉(zhuǎn)運是提高植物修復(fù)效率的2種重要途徑^［2］。因此，強化富集植物對重金屬土壤修復(fù)能力的研究引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注。

植物內(nèi)生菌，特別是內(nèi)生細(xì)菌，對于提高植物的環(huán)境適應(yīng)性起到了至關(guān)重要的作用^［3］。作為與植物長期協(xié)同演化的結(jié)果，植物內(nèi)生細(xì)菌具有多種生物學(xué)功能，可以通過分泌植物生長激素、鐵載體、ACC 脫氨酶、抗生素等來促進宿主營養(yǎng)吸收和生長，提高宿主對生物和非生物脅迫的耐受性和抗性^［4］。植物內(nèi)生細(xì)菌在重金屬污染修復(fù)方面也發(fā)揮著重要作用，一些研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌采用原位鈍化的方式，通過吸附、吸收、沉淀、絡(luò)合、轉(zhuǎn)化等方式對重金屬離子進行固定^［5］，降低重金屬離子的生物毒性，從而緩解重金屬脅迫對宿主的損害^［6］；另有研究表明，巨大芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌等植物內(nèi)生細(xì)菌^［7］，通過酸化根際環(huán)境、溶解金屬礦物^［8］、提高根表面積等機制促進植物對重金屬的吸收，提高植物提取的效率^［9］。目前，內(nèi)生菌促進宿主應(yīng)對環(huán)境脅迫作用的研究限于單一菌種的特定功能，關(guān)于內(nèi)生菌群多樣性和穩(wěn)定性對宿主耐受性和抗性影響的研究報道較少。內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性是其功能形成的重要基礎(chǔ)^［10］，主要受各種生物（如細(xì)菌種類、土壤微生物豐度、宿主植物與內(nèi)生菌互作、宿主植物基因型、生態(tài)型和發(fā)育階段等）和非生物（土壤環(huán)境）因素的影響。研究微生物群落多樣性對植物內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性及抗逆境能力的影響，對提高富集植物修復(fù)效率具有重要意義。

刺兒菜（Cirsium arvense var.integrifolium Wimm.amp; Grab.），是菊科薊屬多年生草本植物，適應(yīng)性很強，耐寒、耐旱、耐貧瘠、任何氣候條件下均能生長，且根系發(fā)達(dá)、生長快、生物量大、遍布全國各地^［11］。目前對于刺兒菜的研究集中于其營養(yǎng)成分、藥用價值等，也有關(guān)于刺兒菜對重金屬具有富集能力的少量報道，但鮮見刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性對其抵御Cd脅迫相關(guān)方面的研究。刺兒菜作為一種潛在的Cd污染修復(fù)植物，研究刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌群落、強化刺兒菜富集特征、增強其修復(fù)效率具有重要意義。

該研究通過盆栽試驗明確了Cd脅迫下內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)以及刺兒菜對Cd的吸收、轉(zhuǎn)運特征，為刺兒菜修復(fù)Cd污染土壤及其富集能力的強化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

盆栽試驗采集沈陽市渾南區(qū)耕地的表層土壤（5～20 cm），將采集的土壤過5 mm篩，去除土內(nèi)雜物，將CaCl2·2.5H2O施加到土壤中，使土壤 Cd²⁺添加水平為0、8 mg/kg（分別標(biāo)記為Cd0、Cd8），室溫條件下平衡60 d，該研究對原生土壤進行滅菌處理，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)（植物內(nèi)生菌主要來源之一），對植物內(nèi)生細(xì)菌進行重塑。將重塑處理（ST）土壤與未滅菌處理（NT）土壤進行對比，觀察不同植物內(nèi)生細(xì)菌群落對Cd脅迫的響應(yīng)。稱取5 kg土壤裝入塑料袋，在高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌2次，每次滅菌時間為0.5 h，滅菌間隔時間為3 d。將刺兒菜種子均勻播種到盆中，出苗后，定期間苗，最終每盆保留3株植物，放置于溫室內(nèi)培養(yǎng)，刺兒菜生長旺盛期（60 d左右），采集植物進行DNA提取。

1.2樣品處理

將采集到的刺兒菜樣本先在自來水下沖洗，去除表面雜質(zhì)。用無菌濾紙吸干植物表面水分。選擇完整的植物，切成2cm的小段，在70%乙醇中浸泡1.5min，無菌水沖洗3次，再對植物使用3%次氯酸鈉溶液處理3min進行表面消毒，用無菌水沖洗5次，裝入無菌離心管中，最后將樣品凍存于液氮中并于-80℃下儲存直至DNA提取。

1.3DNA提取與測序

每個刺兒菜樣本用量約0.5g，采用CTAB法進行DNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。采用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）對細(xì)菌V5～V7區(qū)域進行擴增，以獲得目的基因片段。將不同樣品的PCR擴增物寄送深圳微科盟科技集團，使用Illumina測序平臺進行上機測序。

1.4統(tǒng)計分析

利用Wekemo（https：//www.bioincloud.tech/）軟件處理測序結(jié)束的原始數(shù)據(jù)，包括α-多樣性指數(shù)、β-多樣性指數(shù)、菌群組成及豐度。試驗生物量、Cd含量、Cd累積量等數(shù)據(jù)采用SPSS26軟件進行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1Cd脅迫下刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌多樣性差異性分析

總體上，Cd脅迫會降低刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌多樣性，NT處理表現(xiàn)得更為明顯。ST處理會提高刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性（表1）。Cd脅迫（Cd8）條件下的NT處理組植物內(nèi)生細(xì)菌群落Chao1指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)均顯著低于無外源Cd處理（Cd0）中NT組。在Cd脅迫條件下，ST處理組植物內(nèi)生細(xì)菌的Chao1、Shannon-Wiener、Simpson指數(shù)均顯著高于NT處理。在無Cd脅迫（Cd0）條件下，ST處理組僅Chao1指數(shù)顯著高于NT組。

基于Bray-Curtis距離對Cd脅迫與內(nèi)生菌重塑下刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌群落差異PCoA分析結(jié)果顯示（圖1），Cd脅迫與內(nèi)生菌重塑均影響了刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（Plt;0.05）。內(nèi)生菌重塑（R2=0.218，P=0.011）對刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于Cd脅迫（R2=0.201，P=0.028）。

2.2Cd脅迫下刺兒菜內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

對門水平相對豐度＞1%的細(xì)菌種類進行分析，在Cd0和Cd8水平上各處理組中的主要優(yōu)勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota），這2個優(yōu)勢菌門分別占Cd0_NT、Cd0_ST、Cd8_NT、Cd8_ST各處理組細(xì)菌總量的90.29%、82.64%、86.35%、88.28%。屬水平相對豐度＞1%的細(xì)菌種類分析顯示（圖2），在Cd8水平上ST處理組的植物內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、德沃斯氏菌屬（Devosia）；NT處理組的植物內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、副球菌屬（Paracoccus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異常球菌屬（Deinococcus）。在Cd0水平上ST處理組的植物內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、鏈霉菌屬（Streptomyces）；NT處理組的植物內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、弧菌屬（Vibrio）。Cd脅迫增加了鞘氨醇單胞菌屬、異常球菌屬的相對豐度，在Cd8水平上ST處理降低了德沃斯氏菌屬的相對豐度，增加了異常球菌屬的相對豐度。其中鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬、德沃斯氏菌屬是報道的具有植物促生特性的種群。

2.3Cd脅迫和內(nèi)生菌重塑對刺兒菜生物量及鎘積累的影響

從表2可以看出，Cd脅迫處理中刺兒菜的生物量顯著高于對照組，其中根、莖、葉生物量在Cd脅迫下增加。Cd脅迫條件下ST、NT處理中刺兒菜生物量均顯著高于無外源Cd添加處理（Plt;0.05）。Cd脅迫條件下的NT處理中刺兒菜根和葉生物量顯著高于未添加Cd的NT處理32.6%和34.6%（Plt;0.05）。

從表3可以看出，刺兒菜具有良好的Cd富集能力，富集系數(shù)、轉(zhuǎn)移系數(shù)均大于1。根與葉是主要儲存Cd²⁺的器官，各組織器官中Cd含量從高到低依次為葉＞莖＞根；Cd累積量從高到低依次為葉＞根＞莖。內(nèi)生菌重塑（ST）處理改變了刺兒菜的富集特征，各器官Cd含量、Cd累積量與富集系數(shù)均顯著高于NT處理（Plt;0.05）。

3討論與結(jié)論

土壤微生物群落作為植物內(nèi)生菌的潛在種子庫^［12］，土壤中微生物種子庫的改變會影響與植物相關(guān)的微生物群落的組合，內(nèi)生菌定殖植物體內(nèi)的過程中是由宿主、微生物和環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用形成的^［13］。該研究發(fā)現(xiàn)對土壤微生物進行滅菌處理，改變土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)會影響與植物相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)和組成。內(nèi)生菌多樣性是植物生理狀態(tài)評價指標(biāo)之一，有研究指出，植物內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性越高，宿主植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性越強^［14］。該試驗中土壤重塑處理（ST）能增加內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性，可能由于原生土壤中微生物群落復(fù)雜^［15］，在短期內(nèi)植物與土壤相互作用的影響較少^［16］，而滅菌處理下土壤微生物與植物相互作用共同塑造重建微生物群落。

植物內(nèi)生細(xì)菌能影響重金屬污染土壤中植物的生長和修復(fù)效率。在Cd脅迫下，刺兒菜的生物量明顯提高（包括根和葉片），這可能是內(nèi)生細(xì)菌具有獨特的生物學(xué)功能如固氮、溶磷、產(chǎn)生鐵載體、分泌植物激素吲哚乙酸、產(chǎn)生ACC脫氨酶等促進植物生物量累積^［17］。曹晶晶等^［18］將耐鹽固氮菌接種到玉米上，促進玉米根系發(fā)育，顯著提高了玉米的生物量。萬水霞等^［19］篩選出的根際促生菌CH07、FD11接種于莧菜，對莧菜株高及地上部鮮重有積極作用。內(nèi)生細(xì)菌還可以通過促進根部活動強度，相應(yīng)地提高植物對重金屬的吸收能力以及修復(fù)效率^［14］。有研究表明鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬、德沃斯氏菌屬等優(yōu)勢種群為植物促生菌^［7］，刺兒菜在Cd脅迫下募集的鞘氨醇單胞菌屬、德沃斯氏菌屬作為優(yōu)勢菌屬，前者通過高效的代謝調(diào)控機制和基因調(diào)控能力，可以促進植物生長提高植物的抗重金屬脅迫能力^［20］，后者為α-變形菌綱的根瘤菌，能產(chǎn)生植物激素，影響根的發(fā)育，促進植物對土壤中營養(yǎng)元素的吸收^［21］。由此可知，植物在受到Cd脅迫時會改變自身群落結(jié)構(gòu)，主動募集特定的功能微生物，這些募集到的細(xì)菌可能提高刺兒菜的耐受能力和促進刺兒菜對Cd的富集。

綜上所述，刺兒菜作為富集植物在進行修復(fù)重金屬Cd污染土壤時，通過募集特定的功能微生物與內(nèi)生菌群落協(xié)同互作，共同應(yīng)對Cd脅迫。

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