張威　許文靜　許亞男　張紅梅　劉曉慶　崔曉艷　陳新　陳華濤

摘要： 高油酸能夠顯著提升大豆食用油的穩(wěn)定性和食用價值，是大豆品質改良的育種目標之一。為提高大豆籽粒油酸含量，本研究采用CRISPR/Cas9多基因編輯技術，同時敲除負調控大豆油酸含量的2個關鍵基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B。采用農桿菌介導的大豆子葉節(jié)轉化方法獲得20株T₀代陽性苗，但發(fā)生基因編輯的株系只有11個，其中GmFAD2-1A發(fā)生突變的有7株，GmFAD2-1B發(fā)生突變的有10株，這2個基因同時發(fā)生突變的有6株。經(jīng)過加代純合后，檢測轉基因株系（T₃代）大豆籽粒的脂肪酸組分，發(fā)現(xiàn)油酸含量顯著提升，最高達81.38%，而亞油酸含量則顯著降低，獲得了高油酸新種質。本研究采取多基因敲除策略，成功突變大豆基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B，并獲得高油酸大豆突變體株系，為高油酸大豆育種提供了新的種質資源。

關鍵詞： CRISPR/Cas9基因編輯;大豆;油酸;GmFAD2-1A;GmFAD2-1B

中圖分類號： S565.1 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0321-07

Creation of high oleic acid soybean lines by CRISPR/Cas9

ZHANG Wei¹， XU Wen-jing^1，2， XU Ya-nan^1，3， ZHANG Hong-mei¹， LIU Xiao-qing¹， CUI Xiao-yan¹，CHEN Xin¹， CHEN Hua-tao¹

（1.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;3.College of Life Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： Improving the oleic acid is one of the important objectives for soybean breeding and improvement and will improve the stability and edible value of soybean oil. In the present study， we applied CRISPR/Cas9 gene editing to knock out GmFAD2-1A and GmFAD2-1B， which negatively regulate oleic acid content in soybean. By Agrobacterium-mediated transformation using mature cotyledonary node explants， twenty CRISPR/Cas9 T₀transgenic lines were obtained after stable transformation. Among of them， 11 T₀transgenic lines were detected mutations in the GmFAD2-1A or GmFAD2-1B， including seven GmFAD2-1A transgenic lines， 10 GmFAD2-1B transgenic lines， and six GmFAD2-1A/GmFAD2-1B transgenic lines. The fatty acid profile analysis of T₃soybean seeds revealed that the oleic acid content improved obviously， and reached 81.38%， whereas linoleic acid decreased. In this study， the CRISPR/Cas9 gene editing can successfully edit GmFAD2-1A and GmFAD2-1B， and create high oleic acid soybean germplasm， which provides new germplasm resources for the breeding of high oleic acid.

Key words： CRISPR/Cas9 gene editing;soybean;oleic acid;GmFAD2-1A;GmFAD2-1B

大豆[Glycine max （L.） Merrill]源產地為中國，已有5 000多年的種植歷史，是中國重要的經(jīng)濟作物和糧油作物。大豆油脂的主要成分為脂肪酸，而大豆脂肪酸包括5種主要組分，分別為油酸（Oleic acid， OA）、硬脂酸（Stearic acid， SA）、棕櫚酸（Palmitic acid， PA）、亞麻酸（Linolenic acid， LA）和亞油酸（Linoleic acid， LOA），而大豆油的品質主要取決于脂肪酸組分及其配比^[1]。油酸是單不飽和脂肪酸（只含有1個C=C結構），抗氧化作用強，性質穩(wěn)定，增加大豆油酸含量對于提升大豆食用油的穩(wěn)定性和食用價值具有重要作用。有研究結果表明，在動物的脂類代謝過程中，油酸能夠保證有益膽固醇的穩(wěn)定性從而降低有害膽固醇密度，在預防心血管疾病發(fā)生方面發(fā)揮重要作用^[2-4]，同時油酸可以促進高密度脂蛋白與低密度脂蛋白合理比例的形成，有利于人體健康^[5-6]。在加工過程中，由于高油酸植物油脂中多不飽和脂肪酸含量已經(jīng)處于較低水平，因此不需要再進行多不飽和脂肪酸去除工序，有利于人體健康^[7]。因此，提高大豆油脂中油酸的比例對大豆品質改良具有重要意義。

油酸脫氫酶（FAD）在大豆中存在2個非等位基因，分別為 GmFAD2-1和GmFAD2-2。根據(jù)基因的穩(wěn)定性及磷酸化作用不同，大豆GmFAD2-1基因又可以分為GmFAD2-1A 和GmFAD2-1B2個基因，分別位于10號染色體和20號染色體。一些研究結果表明，GmFAD2-1A和GmFAD2-1B共同調控大豆油酸與亞油酸的比例，調控大豆油脂中油酸和亞油酸的含量^[8-12]，Li 等^[12]發(fā)現(xiàn)在酵母細胞中異源表達大豆GmFAD2-1B基因后，在酵母中能夠檢測到亞油酸，且含量顯著提高，這意味著GmFAD2-1B可以調控亞油酸的合成。利用傳統(tǒng)基因聚合育種技術，Pham等^[8-9]聚合GmFAD2-1A和GmFAD2-1B的優(yōu)異等位變異位點后，大豆油酸含量能夠達到80%以上，同時發(fā)現(xiàn)單個基因突變，大豆的油酸含量也會顯著提高。Haun等^[10]利用轉錄激活因子效應物核酸酶技術（TALENs）靶向編輯大豆基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B，同樣獲得了大豆油酸含量高達80%以上的轉基因株系后代。利用RNAi 技術干擾GmFAD2-1A和GmFAD2-1B的表達，發(fā)現(xiàn)不論是干擾單個基因還是干擾2個基因的表達，轉基因后代中大豆油酸含量都會顯著提升，可達到27.38%～81.90%^[13-15]。近年來，Do 等^[11]同時將GmFAD2-1A和GmFAD2-1B 2個基因同時敲除，在陽性大豆株系后代中檢測到油酸含量超過80%的高油酸大豆株系，而侯智紅等^[16]發(fā)現(xiàn)，大豆脂肪酸組分中油酸含量隨著大豆GmFAD2-1A基因被敲除而顯著提升。總體而言，上述2個關鍵基因在大豆油酸代謝途徑中發(fā)揮重要作用，是負調控大豆油酸含量的2個主要基因。

本研究擬針對上述2個負調控大豆油酸含量基因的DNA序列設計靶標RNA，并獲得基因敲除重組載體。利用農桿菌介導法轉化大豆品種Williams 82，對GmFAD2-1A和GmFAD2-1B進行編輯，創(chuàng)制油酸含量高的大豆新材料。

1 材料與方法

1.1 遺傳受體材料及基因編輯相關載體

以大豆品種Williams 82為遺傳轉化的受體；pGmU3、pGmU6和CRISPR/Cas9質粒（pSCm）均由南京農業(yè)大學喻德躍教授饋贈。

1.2 靶標位點gRNA 的設計

利用在線網(wǎng)站CRISPR-P （http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）分別設計長度為20 bp 的靶標位點序列（guide RNA，gRNA），靶標的位置在GmFAD2-1A和GmFAD2-1B的外顯子區(qū)域，其引物分別為U6-FAD2-1A-F/U6-FAD2-1A-R和U6-FAD2-1B-F/U6-FAD2-1B-R（表1），構建載體鑒定測序引物Seq-test-F/Seq-test-R和Bar基因篩選標記擴增引物Bar-F/Bar-R、FAD2-1A_test-F/FAD2-1A_test-R和FAD2-1B_test-F/FAD2-1B_test-R，用來檢測轉基因株系中GmFAD2-1A和GmFAD2-1B突變位點（表1）。

1.3 轉基因陽性苗的獲得及后代鑒定

遺傳轉化受體為容易獲得陽性苗后代的大豆品種Williams 82；利用農桿菌（EHA105）介導的大豆子葉節(jié)遺傳轉化法進行大豆遺傳轉化^[17]。

使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取陽性苗株系后代及野生型對照Williams 82的基因組DNA，為獲得轉基因植株，利用特異引物PCR擴增篩選標記基因Bar來確定陽性苗，檢測引物為Bar-F/Bar-R。用FAD2-1A_test-F/FAD2-1A_test-R和FAD2-1B_test-F/FAD2-1B_test-R 2對引物分別PCR擴增轉基因植株GmFAD2-1A和GmFAD2-1B的堿基序列，并對PCR產物進行測序。

1.4 大豆脂肪酸組分的提取和檢測

用粉碎機粉碎大豆種子，過60目篩，混勻備用。大豆脂肪酸組分的提取和檢測方法參考昝光敏等^[18]的方法。將適量的大豆粉放入2 ml離心管中，加入1 ml甲醇鈉，50 ℃水浴加熱35 min。然后加入1 ml正己烷，2 000 r/min離心5 min，取上清液放置于色譜專用樣品瓶中，進行氣相色譜檢測。試驗設置3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 基因編輯載體pSCm-GmFAD2-1A/GmFAD2-1B的構建

將GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因的靶標序列（sgRNA）同時重組到CRISPR/Cas9基因編輯載體，獲得pSCm-GmFAD2-1A/GmFAD2-1B雙敲除突變載體（圖1A），并轉化到大腸桿菌中，為確定載體構建的準確性，提取菌落 PCR鑒定后正確的陽性單克?。▓D1B）的質粒并進行測序，測序所用的特異性引物為Seq-test-F和Seq-test-R（表1），利用凍融法將正確的基因編輯重組質粒轉化到根癌農桿菌EHA105中，用于后續(xù)的大豆遺傳轉化。

2.2 轉基因陽性苗后代鑒定

經(jīng)過遺傳轉化后，我們一共獲得以大豆品種Williams 82為受體的轉化幼苗20株。以提取的幼苗葉片DNA為模板，利用特異性引物Bar-F/Bar-R（表1）對重組敲除質粒上的篩選標記Bar基因進行擴增，凝膠電泳結果（圖2A）表明，這20株幼苗都可以檢測到篩選標記Bar基因，即基因編輯重組載體成功插入到大豆基因組中。以20株幼苗葉片DNA為模板，利用FAD2-1A_test-F/FAD2-1A_test-R和FAD2-1B_test-F/FAD2-1B_test-FR 2對引物分別特異性擴增2個基因的靶標位點并進行測序。測序結果（圖2B）表明，7株陽性苗在GmFAD2-1A-sgRNA位置出現(xiàn)雙峰，占35%；10株陽性苗在GmFAD2-1B靶標位置發(fā)生突變，占50%；2個基因靶標位點附近同時發(fā)生突變的共有6株，占30%。

2.3 脂肪酸組分

我們在來自同一T₀代單株且經(jīng)過2次加代獲得的T₃代幼苗中檢測到3種不同類型的純合突變家系，即只有GmFAD2-1A發(fā)生了突變且純合的突變株系，只有GmFAD2-1B發(fā)生了突變且純合的突變株系以及這2個基因都發(fā)生突變且完全純合的突變株系，上述3個純合株系都來自于同一個T₀代單株幼苗。

GmFAD2-1A和GmFAD2-1B的基因編輯靶標位點都設計在基因外顯子上（圖3），PCR特異擴增上述3種突變體的2個基因并進行測序，結果表明，GmFAD2-1A突變純合株系存在1個340 bp的缺失，該突變位于GmFAD2-1A基因的第二外顯子區(qū)域；GmFAD2-1B突變純合株系存在1個1 bp的缺失，該突變位于GmFAD2-1B基因的第二外顯子區(qū)域，上述2種缺失突變都導致轉錄提前終止，氨基酸數(shù)目減少，蛋白質功能缺失。而在GmFAD2-1A和GmFAD2-1B 雙突變純合突變株系 中，在GmFAD2-1A和GmFAD2-1B靶標位點附近分別發(fā)生了340 bp和1 bp的堿基缺失（圖3）。

利用氣相色譜法檢測種子脂肪酸組分發(fā)現(xiàn)上述3種突變體株系的油酸含量均極顯著提高（P<0.01），亞油酸含量極顯著下降（P<0.001），棕櫚酸含量顯著降低（P<0.05）（表2），3種突變體株系的油酸含量分別為58.56%、43.18%和81.38%，是野生型Williams 82（22.03%）的2.66倍、1.96倍和3.69倍；我們發(fā)現(xiàn)，與野生型Williams 82相比，3種突變體株系的亞油酸和棕櫚酸含量都顯著降低，其中亞油酸平均含量分別為23.46%、36.96%和3.63%，棕櫚酸平均含量分別為7.83%、8.43%和6.09%；而硬脂酸和亞麻酸含量則沒有顯著變化。上述突變體株系油酸和亞油酸含量的顯著變化，說明在大豆中，GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因是調控大豆油酸和亞油酸代謝途徑的關鍵基因。

3 討論

大豆油在中國飲食結構中發(fā)揮著重要作用，提高大豆油品質對于改善國人飲食結構具有重要意義。研究結果表明，高油酸植物油有益于身體健康，它在維持有益的高密度脂蛋白的同時降低對人體不利的低密度脂蛋白^[19-20]。高油酸含量的橄欖油因其有益于人類健康，而受到國人的追捧。然而，由于氣候及地理原因橄欖樹無法在中國種植生產，因而絕大部分橄欖油只能從地中海國家進口，價格昂貴，普通人難以消費。因此，創(chuàng)制高油酸大豆新品系、品種，壓榨出高油酸大豆油則為改善國人的飲食結構提供可能。

近年來，作為第三代基因編輯技術， CRISPR/Cas9 基因編輯技術得到了十分迅速的發(fā)展^［21-29］。與第一代基因編輯技術（鋅指核酸酶技術，ZFN）和第二代基因編輯技術（轉錄激活因子效應物核酸酶技術，TALEN）相比，該技術簡單靈活，基因編輯效率和編輯精確度高，目前已得到大范圍的應用^[30]。由于CRISPR/Cas9基因編輯技術能夠高效精準地編輯植物基因組，因而在作物分子育種方面具有巨大的應用前景。目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術在大豆產量、開花期、大豆蛋白質含量、耐逆性等方面的改良上應用已有較多報道^[31-34]。大豆 GmFAD2-1A 和 GmFAD2-1B是決定大豆籽粒油酸含量的主要基因^{[12，35]}，通過抑制這2個基因的表達，可以顯著提高大豆籽粒中油酸和亞油酸比例。已有眾多的研究者通過同時抑制GmFAD2-1A和GmFAD2-1B 基因表達，獲得油酸含量顯著提高到 80%的轉基因大豆材料^[10，13]。在這些研究中，油酸含量提高到 80%的轉基因大豆均為 FAD2-1A 與 FAD2-1B 基因的雙突變純合體，而這些研究中獲得的單基因突變體，油酸含量雖然也得到顯著提高，但提高的程度比雙突變體低的多，只能提高到27%～50%。這些研究結果都表明，只有當 GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因同時突變時，油酸含量才能提高到 80%，從而達到高油酸的標準。本研究運用多靶點基因敲除系統(tǒng)，構建了可以同時敲除GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因的基因編輯載體，單個基因發(fā)生基因編輯（突變）效率分別達到35%和50%，雙基因同時發(fā)生基因編輯（突變）效率達到30%，在轉基因后代中獲得了多種不同類型的突變株系。純合突變體株系油酸含量遠遠高于野生型，油酸含量最高時超過80%，與橄欖油的油酸含量不相上下。我們創(chuàng)制的能夠穩(wěn)定遺傳的大豆突變體材料，為大豆品質改良育種提供了新的基因資源，另一方面，外源基因骨架和篩選標記在遺傳轉化的后代中經(jīng)過幾次自交后丟失，即最終產生Cas9-free的突變體植株，這也為高油酸大豆育種提供了新的種質資源。

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（責任編輯：陳海霞）