張 可，王小玉，黃淑瑩，夏佳敏，黃四洲

1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500); 2.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610500);3.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610500); 4.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室(成都 610500)

多胺是一種低分子量的簡(jiǎn)單脂肪胺，存在于絕大部分生物體內(nèi)。在哺乳動(dòng)物中，多胺對(duì)蛋白質(zhì)的合成、抗氧化損傷、離子通道活性、細(xì)胞增殖等起著重要作用[1-2]。腐胺、亞精胺和精胺是真核系統(tǒng)中多胺的主要成分，由鳥氨酸或S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，SAM)在鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)作用下脫羧而成。這條合成途徑需要1個(gè)氨基丙基，由腺苷甲硫氨酸脫羧酶(adenosylmethionine decarboxylase 1,AMD1)提供，故AMD1是合成精胺和亞精胺的關(guān)鍵調(diào)控酶[3]。AMD1在多種癌組織中高表達(dá)，是治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)之一。在慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)慢性期向急變期發(fā)展的過程中，AMD1的表達(dá)明顯上調(diào)，與CML患者預(yù)后不良有關(guān)[4]。AMD1在雷帕霉素靶蛋白激活的前列腺癌組織中高表達(dá)，提示AMD1或可作為治療該疾病的潛在靶點(diǎn)[5]。AMD1在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，是肝癌預(yù)后不良的因素之一[6]。有研究[7]表明，AMD1與人胃癌的惡性程度密切相關(guān)。AMD1在各類腫瘤中的作用已有相關(guān)報(bào)道，但在胚胎發(fā)育過程中的作用及機(jī)制尚未明確。

隨著ZFN[8]、TALEN[9]、CRISPR/Cas9[10]等基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，突變體的快速鑒定成為了一項(xiàng)重要工作。Cas9蛋白在向?qū)NA(single guide RNA, sgRNA)的引導(dǎo)下對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行切割，可產(chǎn)生不同的突變類型：長(zhǎng)片段缺失可在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)多個(gè)條帶；短片段缺失以第二代DNA測(cè)序技術(shù)[11]為主要驗(yàn)證方法，但該技術(shù)所需時(shí)間長(zhǎng)，因此需尋找一種快速鑒定短片段缺失的檢測(cè)方法。斑馬魚單次產(chǎn)卵量大、發(fā)育周期短、胚胎透明，是研究胚胎發(fā)育的理想模型[12-13]。本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建斑馬魚amd1突變體，并針對(duì)突變的堿基位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)建立快速鑒定短片段缺失的方法，以期為進(jìn)一步研究amd1在胚胎發(fā)育中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型(wild type,WT)斑馬魚(AB品系)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件喂養(yǎng):成年斑馬魚在28.5 ℃系統(tǒng)水中養(yǎng)殖，系統(tǒng)水保持每日紫外線照射，pH常年穩(wěn)定在7.6左右。

1.2 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑主要包括Prim STAR Max(Takara公司,美國);T7轉(zhuǎn)錄試劑盒(NEB公司，美國);T3 Super PCR Mix(Tsingke公司，北京);EnGen Cas9 NLS(NEB公司，美國);cycle pure kit(OMEGA公司，美國);探針合成試劑盒(Roche公司，瑞士)。實(shí)驗(yàn)儀器主要包括斑馬魚氣動(dòng)皮升顯微注射泵PV820(WPI公司，美國);SZX2-ILLT熒光顯微鏡(Olympus公司，日本);PCR核酸擴(kuò)增儀(BIO-RAD公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 CRISPR/Cas9靶點(diǎn)及驗(yàn)證引物設(shè)計(jì) 斑馬魚amd1基因的全長(zhǎng)序列在NCBI網(wǎng)站上下載，根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)2個(gè)sgRNA靶點(diǎn)序列(sgRNA1和sgRNA2)。經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)靶點(diǎn)均在斑馬魚基因組中具有特異性，根據(jù)2個(gè)sgRNA靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物amd1-check-5′和amd1-check-3′(表1)。

表1 靶點(diǎn)和驗(yàn)證引物序列

1.3.2 sgRNA的合成與純化 以amd1-sgRNA1、oligo2與amd1-sgRNA2、oligo2為引物，按照PCR反應(yīng)程序(98 ℃預(yù)變性3 min,98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸5 min)分別合成PCR產(chǎn)物。將二者混合后用PCR試劑盒回收純化，得到合成sgRNA模板，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物回收純化后，測(cè)定濃度并進(jìn)行電泳檢測(cè)，分裝保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.3 顯微注射 在注射的前一晚，將1對(duì)成年WT斑馬魚放在交配缸中，加入適量的系統(tǒng)水后，將雌魚和雄魚用擋板隔開，在次日8∶00拔掉擋板，讓雌、雄魚交配，10 min左右即可產(chǎn)生受精卵。按照Cas9蛋白200 ng/μL、sgRNA 150 ng/μL配制注射溶液，在斑馬魚胚胎1細(xì)胞期注射1 nL混合溶液于細(xì)胞中，注射完畢后放入28.5 ℃的孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，定期更換系統(tǒng)水。

1.3.4 檢測(cè)sgRNA及篩選突變體 從“1.3.3”制備的斑馬魚胚胎中，隨機(jī)挑選4個(gè)發(fā)育畸形的胚胎和6個(gè)發(fā)育正常的胚胎于PCR管中，每管加入50 μL DNA裂解液，按照PCR程序(55 ℃ 5 h，95 ℃ 10 min，12 ℃ 2 h)獲得斑馬魚基因組DNA。以amd1-check-5′和amd1-check-3′為引物擴(kuò)增DNA，通過第二代DNA測(cè)序技術(shù)判斷靶點(diǎn)是否有效。若有效，將剩余的斑馬魚胚胎喂養(yǎng)至性成熟，即為F0代;F0代與WT斑馬魚交配得到F1代;通過拔魚鱗提取DNA，PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA后送測(cè)序，得到F1代雜合子;F1代與WT斑馬魚交配后，測(cè)序篩選出F2代雜合子;將突變類型一致的F2代自交，得到F3代。通過PCR技術(shù)篩選F3代純合子，第二代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 設(shè)計(jì)鑒定純合子的引物 針對(duì)突變的堿基位點(diǎn)，設(shè)計(jì)4個(gè)引物，amd1-screen-(1)-5′至amd1-screen-(4)-5′，4個(gè)鑒定引物分別和amd1-check-3′為4對(duì)上、下游引物，以amd1純合子斑馬魚DNA為模板，按照PCR程序(98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min，12 ℃ 2 h)擴(kuò)增DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，無條帶為純合子，對(duì)應(yīng)引物為最佳鑒定引物(表2)。

表2 純合子鑒定引物序列

1.3.6 探針的制備及原位雜交 以線性化載體為模板，用探針合成試劑盒合成地高辛標(biāo)記的RNA反義探針，異丙醇純化后用電泳檢測(cè)條帶是否正確，最后保存于-20 ℃?zhèn)溆?。收集斑馬魚胚胎，用4%多聚甲醛固定，于4 ℃冰箱保存，第2天用PBST溶液洗3次，5 min/次，然后用無水甲醇脫水，15 min/次，放入-20 ℃冰箱保存。原位雜交技術(shù)按照文獻(xiàn)[14]步驟進(jìn)行。

1.3.7 熒光體視顯微鏡拍照 原位雜交后的胚胎用100%甘油固定后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA對(duì)斑馬魚amd1基因特異位點(diǎn)的編輯

針對(duì)amd1基因靶點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性sgRNA,并在體外轉(zhuǎn)錄合成(圖1A)。F0代斑馬魚胚胎提取基因組DNA后，用PCR擴(kuò)增該靶標(biāo)區(qū)域DNA(圖1B)。測(cè)序結(jié)果顯示，在靶點(diǎn)處(紅色方框內(nèi)序列為Cas9蛋白靶點(diǎn))出現(xiàn)套峰(圖1C)，sgRNA可對(duì)amd1特異位點(diǎn)進(jìn)行編輯。

圖1 sgRNA對(duì)斑馬魚amd1基因特異位點(diǎn)的編輯

2.2 斑馬魚amd1突變體的構(gòu)建結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)1代斑馬魚胚胎存在2種突變類型(圖2A～B)。WT斑馬魚胚胎在CDS區(qū)域1 002 bp處出現(xiàn)終止密碼子，而這2種突變體分別在168、141 bp處提前產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止，這2種突變類型均為錯(cuò)義突變(圖2C)。成年的F1代amd1雜合子斑馬魚與WT斑馬魚雜交，測(cè)序篩選出F2代雜合子，自交后得到純合子、雜合子、WT的比例約為1∶2∶1，符合孟德爾遺傳定律，最終得到穩(wěn)定遺傳的斑馬魚amd1突變體。整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示，受精后24 h，在WT斑馬魚胚胎中AMD1主要在頭部、眼睛、體節(jié)及內(nèi)胚層區(qū)域表達(dá)，而在amd1純合子斑馬魚胚胎中，AMD1的表達(dá)明顯減弱(圖2D)。

圖2 斑馬魚amd1突變體的檢測(cè)結(jié)果

2.3 斑馬魚amd1突變體的鑒定結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，3對(duì)引物以純合子DNA為模板擴(kuò)增后有條帶出現(xiàn)，amd1-screen-(3)-5′擴(kuò)增后無條帶出現(xiàn)，故amd1-screen-(3)-5′為最佳鑒定引物(圖3A～B)。用此引物來鑒定amd1 F3代斑馬魚胚胎是否為純合子，隨機(jī)選擇其中16個(gè)胚胎與1個(gè)WT斑馬魚胚胎提取DNA，PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，有6個(gè)樣本無條帶(圖3C)。為了排除模板的問題，使用amd1-check-5′和amd1-check-3′這對(duì)引物對(duì)所有模板進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)均存在條帶(圖3D)，表明每個(gè)樣本的PCR模板均沒有問題。進(jìn)一步將圖3D所示PCR樣本3、6、8、9等測(cè)序，發(fā)現(xiàn)所測(cè)樣本均為2種突變類型的純合子(圖3E)。

圖3 amd1純合子斑馬魚胚胎的篩選與測(cè)序結(jié)果

3 討論

CRISPR/Cas9是繼ZFN[8]、TALENs[9]等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù)，具有成本低、效率高[10]等優(yōu)點(diǎn)。通過人工設(shè)計(jì)的sgRNA來識(shí)別目的基因組序列，引導(dǎo)Cas9蛋白酶進(jìn)行有效切割DNA，最終達(dá)到對(duì)基因組DNA進(jìn)行編輯的目的[10]。

研究[5-7]表明，AMD1在癌癥發(fā)生中起著重要作用，但其在胚胎發(fā)育中的作用尚不清楚。本研究使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建斑馬魚amd1突變體,針對(duì)amd1外顯子1設(shè)計(jì)了2個(gè)sgRNA靶點(diǎn)序列，通過測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證其有效性。將成年斑馬魚F0代與WT自交得到F1代，通過測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代斑馬魚有2種突變體。F1代與WT斑馬魚雜交得到F2代，測(cè)序篩選出F2代雜合子后，自交得到F3代穩(wěn)定遺傳的斑馬魚amd1突變體。整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示，受精后24 h,AMD1在WT斑馬魚胚胎的頭部、眼睛、體節(jié)及內(nèi)胚層區(qū)域表達(dá)，而在amd1純合子斑馬魚胚胎中表達(dá)明顯減弱，說明amd1突變體構(gòu)建成功。為快速鑒定純合子，根據(jù)2種不同的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)4個(gè)特異性鑒定引物，使其分別與amd1-check-3′組合成1對(duì)引物，使用PCR擴(kuò)增純合子和WT DNA模板，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后無條帶者則為最佳鑒定引物。在F3代斑馬魚胚胎中，隨機(jī)選取其中16個(gè)胚胎與1個(gè)WT斑馬魚胚胎提取DNA，用amd1-screen-(3)-5′與amd1-check-3′組合擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)存在無條帶樣本，用測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證后均為純合子，因此鑒定純合子的最佳引物為amd1-screen-(3)-5′。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建斑馬魚amd1突變體，并運(yùn)用PCR技術(shù)設(shè)計(jì)鑒定純合子胚胎的引物，使短片段缺失的突變體鑒定變得簡(jiǎn)單，為篩選突變體提供新思路。本研究不足之處在于未深入研究amd1在胚胎發(fā)育中的作用，將在后續(xù)工作中進(jìn)一步開展。