竇瑤杰,鄭慶蒙,徐 晨,張莉蓉,楊衛(wèi)紅

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系 鄭州 450001

藥物代謝酶CYP3A4、CYP3A5和孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)在藥物代謝方面起著非常重要的作用,其中PXR對CYP3A4和CYP3A5基因表達(dá)和調(diào)節(jié)至關(guān)重要[1]。非編碼單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)可通過影響剪切,改變基因表達(dá)及藥物代謝,但多數(shù)非編碼SNP影響基因表達(dá)的機(jī)制尚不完全清楚。HepG2和Huh7是用于藥物代謝相關(guān)研究最常用的肝細(xì)胞[2-4],但目前這兩種細(xì)胞中CYP3A4、CYP3A5和PXR基因的重要非編碼SNP的遺傳背景信息尚不完全清楚,無法滿足相關(guān)遺傳變異研究的最基本的需求。本研究對HepG2和Huh7細(xì)胞中CYP3A4、CYP3A5和PXR基因的重要非編碼SNP基因型進(jìn)行分析,為非編碼SNP影響基因表達(dá)的機(jī)制研究提供遺傳背景信息。

1 材料與方法

1.1 主要材料HepG2和Huh7細(xì)胞株(上海中科院細(xì)胞研究所);基因組DNA提取試劑盒(美國Axygen公司),PCR試劑盒(日本TaKaRa公司),梯度PCR擴(kuò)增儀和凝膠成像系統(tǒng)[Thermo Fisher Scientific(中國)有限公司],水平電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.2 非編碼SNP多態(tài)性分析用基因組DNA提取試劑盒按說明書操作,從培養(yǎng)的HepG2和Huh7細(xì)胞中提取DNA。使用Primer在線引物設(shè)計軟件設(shè)計PCR引物或參考文獻(xiàn)[5]引物序列,由鄭州尚之亞生物技術(shù)有限公司合成引物。CYP3A4 9個SNP(rs2242480、rs35599367、rs2740574、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs12333983、rs4646437、rs35564277)、CYP3A5 rs776746和PXR 4個SNP(rs3814055、rs2276706、rs13059232、rs6785049)引物序列及相關(guān)信息見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步驗證后送鄭州尚之亞生物技術(shù)有限公司測序,將測序結(jié)果與NCBI中預(yù)期序列進(jìn)行比對。

表1 PCR引物序列及相關(guān)信息

2 結(jié)果

測序結(jié)果見圖1～4。

A:CYP3A5 rs77647; B～E:PXR rs3814055、rs2276706、rs13059232和rs6785049

A～I(xiàn):分別為rs2242480、rs35599367、rs2740574、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs12333983、rs4646437和rs35564277

A:CYP3A5 rs776746;B～E:PXR rs3814055、rs2276706、rs13059232和rs6785049

HepG2和Huh7細(xì)胞CYP3A4、CYP3A5和PXR SNP基因型比較結(jié)果見表2。在HepG2細(xì)胞中CYP3A4 rs2242480、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs12333983都為突變雜合子,而在Huh7細(xì)胞中上述前4個SNP為野生純合子,最后1個為突變純合子。其余CYP3A4 rs35599367、rs4646437、rs35564277在這兩種細(xì)胞中都為野生純合子,而rs2740574都為突變純合子。

表2 兩種細(xì)胞CYP3A4、CYP3A5和PXR基因SNP基因型比較

在HepG2和Huh7細(xì)胞中CYP3A5 rs776746分別為突變雜合子和突變純合子。在這兩種細(xì)胞中,PXR rs3814055、rs2276706、rs6785049為突變雜合子,rs13059232為突變純合子。

野生純合子、突變雜合子和突變純合子在HepG2和Huh7細(xì)胞中的數(shù)目分別為3、9、2及7、3、4個,即HepG2細(xì)胞突變雜合子較多,而Huh7細(xì)胞野生純合子及突變純合子較多。

3 討論

CYP3A4、CYP3A5和PXR基因非編碼遺傳變異的功能及機(jī)制研究需要不同基因型的細(xì)胞模型,目前基因編輯SNP技術(shù)的應(yīng)用為相關(guān)研究創(chuàng)造了條件。HepG2和Huh7細(xì)胞系在藥物代謝的研究中已被廣泛使用,因此,我們對這兩種細(xì)胞中上述3個基因的重要非編碼SNP的基因型進(jìn)行了比較分析,為遺傳變異相關(guān)研究提供遺傳背景信息。

通過比較HepG2和Huh7細(xì)胞中CYP3A4基因的9個SNP及1個CYP3A5 SNP,我們發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞中CYP3A4 rs2242480突變雜合子、rs35599367野生純合子和CYP3A5 rs776746突變雜合子基因型與我們前期對HepG2細(xì)胞的研究[5]結(jié)果一致;在Huh7細(xì)胞中,CYP3A5 rs776746突變純合子基因型與以往研究[6]結(jié)果一致。另外,HepG2細(xì)胞中rs2242480和rs776746這兩個SNP都為突變雜合子,Huh7細(xì)胞中rs2242480野生純合子和rs776746突變純合子,支持rs2242480野生等位基因和rs776746變異等位基因(或rs2242480變異等位基因和rs776746野生等位基因)存在強連鎖不平衡關(guān)系[7-8]。使用HepG2細(xì)胞研究CYP3A4遺傳變異對藥物代謝的影響時,不用考慮3個野生純合子SNP(rs35599367、rs4646437和rs35564277)對實驗結(jié)果的影響,而rs2740574突變純合子和突變雜合子SNP(rs2242480、rs3735451、rs2246709、rs4646440和rs12333983)則可能對實驗結(jié)果有影響。使用Huh7細(xì)胞研究CYP3A4遺傳變異對藥物代謝的影響時,不需要考慮7個野生純合子(rs2242480、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs35599367、rs4646437和rs35564277)對實驗結(jié)果的影響,而突變純合子rs12333983和rs2740574可能對實驗結(jié)果有影響。HepG2和Huh7細(xì)胞中CYP3A4及CYP3A5遺傳背景不同,進(jìn)行相關(guān)遺傳變異或連鎖SNP研究時可以根據(jù)其基因型選擇或改造細(xì)胞。

另外,由于PXR影響CYP3A4及CYP3A5的表達(dá),因此,我們也比較了HepG2和Huh7細(xì)胞中PXR的SNP變異情況。我們發(fā)現(xiàn)在這兩種細(xì)胞中PXR rs3814055、rs2276706、rs6785049都為突變雜合子,而rs13059232都為突變純合子,提示這4個PXR SNP可能被CYP3A4及CYP3A5表達(dá)所需要,使用這兩種細(xì)胞用于研究CYP3A4和CYP3A5遺傳變異時需要考慮其可能產(chǎn)生的影響。CYP3A4、CYP3A5和PXR SNP在HepG2細(xì)胞中突變雜合子較多,而在Huh7細(xì)胞中野生純合子及突變純合子較多,提示從適應(yīng)性方面HepG2作為藥物代謝相關(guān)研究的細(xì)胞模型比Huh7細(xì)胞的應(yīng)用范圍會更加廣泛。而且從PubMed檢索“HepG2”及“Huh7”(“Huh-7”)使用情況,分別發(fā)現(xiàn)1981至2023年36 336個結(jié)果及1982至2022年6 912(2 804)個結(jié)果,前者遠(yuǎn)高于后者,也支持了我們的觀點。至于rs2242480作為CYP3A4的增強子[9-10]影響CYP3A4、CYP3A5、PXR基因表達(dá)的機(jī)制及PXR變異在其中所起的作用有待于深入研究。

綜上,HepG2和Huh7細(xì)胞中CYP3A4、CYP3A5重要非編碼SNP變異情況不完全相同,而PXR SNP基因型相同,HepG2細(xì)胞中突變雜合子較多,而Huh7野生純合子及突變純合子較多。本研究結(jié)果為選擇或基因編輯這兩種細(xì)胞株研究CYP3A4、CYP3A5及PXR相關(guān)遺傳變異及其機(jī)制提供了理論依據(jù)。