陳亞然,操然,張瑤瑤,Voglmeir JOSEF,劉麗

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

糖基化反應(yīng)是生物體內(nèi)非常重要的轉(zhuǎn)化反應(yīng)之一,是碳水化合物(即糖基供體)與另一分子(糖基受體如蛋白質(zhì)等)的羥基或其他官能團(tuán)相連形成糖綴合物的反應(yīng)。這些糖綴合物中的碳水化合物部分在機(jī)體內(nèi)參與了廣泛的生命活動(dòng)過程,如細(xì)胞與細(xì)胞相互作用[1-3]、細(xì)胞黏附[4-6]、宿主和病原體相互作用[7-9]、先天和后天免疫[4,10]、中性粒細(xì)胞募集到組織損傷部位等[4],具有重要的生物學(xué)作用。生物體內(nèi)的糖基化過程主要由糖基轉(zhuǎn)移酶催化完成。

β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(β4GalT)是近年來研究最多的糖基轉(zhuǎn)移酶類之一,它是一種由β4GalT1基因編碼的酶[11],負(fù)責(zé)細(xì)胞糖綴合物(糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖)碳水化合物部分中半乳糖基化結(jié)構(gòu)的合成[12]。研究發(fā)現(xiàn),β4GalT對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化,特別是皮膚和小腸細(xì)胞,以及早期的動(dòng)物死亡率均有顯著影響[13-15]。通過氨基酸多序列對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)預(yù)測(cè)分析將β4GalT家族分為4個(gè)亞族,分別為β4GalTⅠ和β4GalTⅡ、β4GalTⅢ和β4GalTⅣ、β4GalTⅤ和β4GalTⅥ,以及β4GalTⅦ[1]。β4GalT家族的各成員定位于染色體的不同位置,目前對(duì)于β4GalT1的功能研究最多。

β4GalT1是機(jī)體中分布最廣泛的糖基化轉(zhuǎn)移酶之一。β4GalT1是一種反式高爾基體常駐酶,在錳離子存在下,它可以將UDP-半乳糖中的半乳糖轉(zhuǎn)移到存在于受體聚糖分子非還原末端存在的N-乙酰氨基葡萄糖分子中,合成具有以β-1,4-糖苷鍵連接的二糖部分LacNAc(UDP-半乳糖+N-乙酰氨基葡萄糖→UDP+N-乙酰氨基乳糖),這在糖蛋白的碳水化合物組分的合成中非常重要[16]。研究表明,β4GalT1參與精卵結(jié)合[17]和胚胎著床過程[18-19],促進(jìn)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)[20]和神經(jīng)節(jié)神經(jīng)軸突的產(chǎn)生和延伸[21],在促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)中也可能發(fā)揮著重要作用[22],并與免疫及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[23]。

在動(dòng)物乳腺中,當(dāng)有α-乳清蛋白存在時(shí),β4GalT1可以和α-乳清蛋白一起形成乳糖合酶,其催化反應(yīng)的受體底物特異性發(fā)生了變化,從原來的乙酰氨基葡萄糖變成葡萄糖,因此用于催化乳中乳糖的合成。α-乳清蛋白是一種無催化活性蛋白,只存在于乳腺中,可與儲(chǔ)存在乳腺中的β4GalT1結(jié)合生成乳糖合酶,催化乳糖的生成,其催化反應(yīng)如下:UDP-半乳糖+葡萄糖→UDP+乳糖,整個(gè)過程涉及到酶活性位點(diǎn)區(qū)域的構(gòu)象變化[24]。

有關(guān)β4GalT1功能的研究很多,但大都是通過將β4GalT1基因在小鼠體內(nèi)敲除而進(jìn)行的。Asano等[13]研究β4GalT1基因敲除對(duì)小鼠生理功能的影響,發(fā)現(xiàn)敲除β4GalT1基因小鼠可以正常出生和繁殖,但是生長(zhǎng)遲緩,以及表現(xiàn)出斷奶前的半數(shù)致死性等,由此可知,完全敲除β4GalT1基因?qū)ι矬w的正常功能有嚴(yán)重影響。然而,將β4GalT1替換成底物為其他已知單糖的轉(zhuǎn)移酶會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生何種影響尚未見報(bào)道,即β4GalT1在體內(nèi)的可替代性如何尚屬未知。因此本研究考慮將β4GalT1突變成GalNAcT,合成乙酰氨基半乳糖基化糖單元結(jié)構(gòu),這樣既沒有簡(jiǎn)單敲除β4GalT1,同時(shí)也不會(huì)在小鼠體內(nèi)引入不存在的糖單元結(jié)構(gòu),以此考察β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠生理功能的影響;并與β4GalT1基因敲除對(duì)小鼠生理功能的影響對(duì)比探究其異同,研究β4GalT1在小鼠體內(nèi)的功能;同時(shí)研究β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠肝中N-鏈寡糖結(jié)構(gòu)的影響,旨在探索β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠肝臟參與解毒、吞噬、代謝、排泄以及免疫等多種復(fù)雜的生物學(xué)過程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司提供;動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒和瓊脂購自北京索萊寶生物科技有限公司;rTaq酶購自TaKaRa公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Lembio公司。其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠的設(shè)計(jì)

利用CRISPR/Cas9技術(shù),獲得β4GalT1基因第286位氨基酸酪氨酸Tyr變?yōu)榱涟彼酟eu,即堿基TAT置換為CTG點(diǎn)突變的純合子小鼠。該過程由上海南方模式生物科技股份有限公司完成。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)

動(dòng)物試驗(yàn)方案經(jīng)過南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。15只小鼠,其中6只純合子(HO),9只雜合子(HE),由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。之后飼養(yǎng)在光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h、溫度(21.0±1)℃、濕度(60±10)%均恒定的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(蘇)2017-0007]。自由交配、采食和飲水,試驗(yàn)期內(nèi),觀察并記錄其日常狀態(tài)及行為、交配情況、子代數(shù)量,測(cè)定體質(zhì)量及器官質(zhì)量等。

1.4 β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠基因型鑒定

1.4.1 樣品采集及鼠尾基因組DNA的提取小鼠的基因型鑒定在小鼠出生7～14 d時(shí)進(jìn)行。由β4GalT1基因點(diǎn)突變的雜合子雌鼠與雜合子雄鼠交配后,得到子代小鼠。剪取大約1 cm的待檢測(cè)子代小鼠的尾巴放于事先滅菌的勻漿器中,充分研磨,然后按照動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(Solarbio)說明書提取小鼠尾巴基因組DNA。

1.4.2β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠基因型的鑒定將提取的小鼠尾巴基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物為mouse-genomic-F(AGGCAGGCAGATCTCAAGTCAGC)和mouse-genomic-R(AAAGCCCACATAGGAA-GCCAAAGT),堿基數(shù)分別為23和24,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系(25 μL):rTaq12.5 μL,mouse-genomic-F 0.5 μL,mouse-genomic-R 0.5 μL,Genomic DNA 1.5 μL,ddH2O 10 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃ 10 min;94 ℃ 40 s,63 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,共34個(gè)循壞;72 ℃ 10 min。用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小,并用Lembio瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收和純化目的基因,然后將目的基因送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠的繁殖、行為學(xué)分析及器官質(zhì)量測(cè)定

1.5.1β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠的繁殖分別選取β4GalT1基因點(diǎn)突變的純合子雌、雄小鼠,雜合子雌、雄小鼠,野生型雌、雄小鼠,雜合子雌小鼠與純合子雄小鼠為親本進(jìn)行交配,自由采食和飲水。記錄小鼠的繁育情況,基因型鑒定同1.4節(jié)。

1.5.2β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠的形態(tài)和行為觀察β4GalT1基因點(diǎn)突變的純合子和野生型小鼠的日常行為并記錄。

懸尾試驗(yàn):用雙面膠將小鼠尾部1 cm處懸于架子上,使其頭部正對(duì)鏡頭,用攝像系統(tǒng)記錄小鼠6 min內(nèi)后4 min的行為變化,包括首次出現(xiàn)不動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間和不動(dòng)狀態(tài)持續(xù)的時(shí)間(不動(dòng)狀態(tài)是指小鼠放棄主動(dòng)掙扎,處于完全不動(dòng)的時(shí)間)。

1.5.3β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠的器官質(zhì)量取純合子小鼠和野生型小鼠各3只,用乙醚麻醉,摘眼球取血,待小鼠死后,解剖小鼠取其各個(gè)器官,稱質(zhì)量并記錄。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件統(tǒng)計(jì),采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.6 β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠肝臟中糖基化的影響

1.6.1 小鼠肝臟樣品的處理經(jīng)基因型鑒定后的純合子小鼠和和野生型小鼠,飼養(yǎng)2～3個(gè)月后,用乙醚麻醉,摘眼球取血;解剖取其肝臟,裝于滅菌的1.5 mL EP管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 小鼠肝臟中N-鏈寡糖的制備1)肝臟的前處理:將純合子小鼠和野生型小鼠的肝臟從-80 ℃冰箱中取出,室溫融化后,置于研缽中,加液氮冷凍并研磨,待磨碎后稱量50 mg備用。

2)N-鏈寡糖的酶解釋放:將稱量好的樣品經(jīng)氯仿-甲醇(體積比為2∶1)去脂處理后,加入50 μL 2.45 mol·L-1的三氯乙酸沉淀蛋白,再用去離子水洗至中性。將處理好的樣品用提前純化好的N-糖苷酶F進(jìn)行消化處理。反應(yīng)步驟如下:加50 μL的6 mol·L-1尿素溶解樣品,待溶解后再依次加入28 μL超純水、23 μL 500 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH7.5)、12.5 μL變性劑(70 mmol·L-1十二烷基硫酸鈉水溶液、3%β-巰基乙醇),將其充分混勻后置于金屬浴中,95 ℃加熱10 min使蛋白變性,然后將樣品置于冰上,待其冷卻至室溫后,加入19 μL 10%的Triton-100溶液混勻,與100 μLN-糖苷酶F在37 ℃條件下孵育過夜。

3)N-鏈寡糖的純化:用SupelcleanTMENVI-CarbTM預(yù)裝柱對(duì)反應(yīng)后的樣品進(jìn)行純化。首先進(jìn)行碳柱的活化,依次用3 mL 80% 乙腈(含0.1% 三氟乙酸)、3 mL蒸餾水、3 mL 80% 乙腈(含0.1% 三氟乙酸)、3 mL 蒸餾水沖洗碳柱;將反應(yīng)后的溶液在12 100g4 ℃離心10 min,用移液器取上清液轉(zhuǎn)移至碳柱中,待其完全流出后,再用3.0 mL蒸餾水沖洗柱子,最后分別收集20% 乙腈和40% 乙腈(均含0.1% 三氟乙酸)洗脫部分(各1.5 mL),將收集好的樣品置于真空離心濃縮干燥機(jī)中旋干。

1.6.3 小鼠肝臟N-鏈寡糖的高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)將旋干后的樣品經(jīng)2-氨基苯甲酰胺(2-AB)溶液標(biāo)記。2-AB溶液配制:35 mmol·L-12-AB,0.1 mol·L-1氰基硼氫化鈉,溶劑為二甲基亞砜和冰醋酸(體積比為7∶3)。取10 μL 2-AB溶液于旋干后的樣品中混勻,65 ℃金屬浴中反應(yīng)4 h。向標(biāo)記處理后的小鼠肝臟N-鏈寡糖加入20 μL純凈水,用渦旋振蕩儀混勻,12 100g離心 2 min,取上清液15 μL與35 μL的乙腈混勻,12 100g離心3 min后取上清液40 μL于進(jìn)樣瓶中,進(jìn)樣量為30 μL。檢測(cè)所用色譜柱為BEH Glycan column(1.7 μm,2.1 mm× 150 mm,Waters);流動(dòng)相A為 50 mmol·L-1甲酸銨溶液(pH4.5),流動(dòng)相B為色譜純級(jí)乙腈;激發(fā)波長(zhǎng)為330 nm,檢測(cè)波長(zhǎng)為420 nm;柱溫設(shè)為60 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠基因型的鑒定

2.1.1 PCR鑒定小鼠基因型由圖1可知:鼠尾DNA經(jīng)擴(kuò)增后序列大小約為500 bp,與目的基因片段大小一致。由圖2可知:基因序列中突變點(diǎn)處為單峰且基因序列為CTG,其對(duì)應(yīng)的小鼠為純合的β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠;突變點(diǎn)處為單峰且基因序列為TAT,對(duì)應(yīng)的小鼠為野生型小鼠;突變點(diǎn)處為雙峰,對(duì)應(yīng)的小鼠為雜合子小鼠。由圖3可知:成年的純合子、雜合子和野生型小鼠外觀上沒有明顯差別。

2.1.2 不同基因型小鼠肝臟中N-鏈寡糖的比較β4GalT1基因點(diǎn)突變純合子和野生型小鼠肝臟中的N-鏈寡糖的UPLC峰譜圖結(jié)果如圖4所示。通過比較2種不同基因型小鼠肝臟中的N-鏈寡糖,發(fā)現(xiàn)純合子小鼠N-鏈寡糖的洗脫時(shí)間在15～40 min時(shí)的峰型圖較野生型小鼠有較大差異,如保留時(shí)間為23和26 min時(shí),兩者峰型差異較大,原因是純合子小鼠體內(nèi)不含β4GalT1,不能將半乳糖轉(zhuǎn)移到N-乙酰氨基葡萄糖上,而野生型小鼠體內(nèi)含有β4GalT1,可以將半乳糖轉(zhuǎn)移到N-乙酰氨基葡萄糖上。含有半乳糖的N-鏈寡糖可以進(jìn)一步進(jìn)行唾液酸化修飾,生成含半乳糖和唾液酸的結(jié)構(gòu),所以純合子小鼠肝臟中N-鏈寡糖峰型圖中的峰較野生型小鼠的峰整體前移,說明β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠肝臟中N-鏈寡糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響,也進(jìn)一步證明純合子小鼠成功突變。

2.2 β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、行為及雌小鼠繁殖能力的影響

2.2.1β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響對(duì)β4GalT1基因點(diǎn)突變的純合子小鼠和野生型小鼠在斷奶前的存活率進(jìn)行記錄,結(jié)果表明:純合子小鼠出生總數(shù)為20只,存活數(shù)為18只,存活率為90%;而野生型小鼠出生總數(shù)為95只,全部存活,存活率為100%。由表1可見:純合子小鼠平均體質(zhì)量增加速度低于野生型小鼠,純合子小鼠組和野生型小鼠組體質(zhì)量在相同周齡時(shí)無顯著差異(P>0.05),在不同周齡時(shí)也無顯著差異(P>0.05)。

表1 純合子和野生型小鼠在出生后不同時(shí)間的體質(zhì)量比較(n=6)Table 1 Body weight comparison of homozygous and wild-type mice at different time after birth g

如表2所示:純合子小鼠主要器官質(zhì)量與野生型小鼠相比均無顯著差異(P>0.05)。因此,β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠各主要器官的質(zhì)量無顯著影響,即對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育沒有顯著影響。

表2 成年的純合子和野生型小鼠各器官質(zhì)量分析(n=3)Table 2 Gravimetric analysis of organs in adult homozygous and wild-type mice g

2.2.2β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠行為的影響日常觀察純合子和野生型小鼠的行為,發(fā)現(xiàn)純合子小鼠行動(dòng)遲緩,對(duì)外界刺激不敏感;而野生型小鼠更活潑,表現(xiàn)為更易在籠盒頂部的鐵架上攀爬。當(dāng)抓握小鼠時(shí),野生型小鼠掙扎得更厲害。純合子小鼠懸尾平均靜止時(shí)間為(104±19)s,占總懸掛時(shí)間的35.4%～51.3%,野生型小鼠平均靜止時(shí)間為(50±7)s,占總懸掛時(shí)間的17.9%～23.8%。純合子小鼠的平均靜止時(shí)間顯著長(zhǎng)于野生型小鼠(P<0.01)。表明純合子小鼠處在抑郁狀態(tài)的時(shí)間更長(zhǎng),即β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)小鼠神經(jīng)發(fā)育過程有顯著影響。

2.2.3β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)雌小鼠繁殖能力的影響選擇β4GalT1基因點(diǎn)突變小鼠的雜合子雌小鼠與雜合子雄小鼠作為親本交配,子代數(shù)目及基因型分布情況如表3所示。通過鼠尾基因組提取,PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序可知,在所得子代小鼠中,純合子小鼠(β4GalT1-/-)15只,占比為13.8%;雜合子小鼠(β4GalT1+/-)62只,占比為56.9%;野生型小鼠(β4GalT1+/+)32只,占比為29.3%。純合子、雜合子、野生型小鼠的比例約為1∶4∶2,子代純合子小鼠所占比例明顯少于孟德爾遺傳定律所應(yīng)占比例,雜合子和野生型小鼠所占比例約為2∶1,符合孟德爾遺傳定律。因此,在雜合子自交繁殖中,子代純合子小鼠的出生率明顯低于正常值。

表3 雜合子小鼠自交組合的子代數(shù)目及比例Table 3 Progeny number and proportion of self-crossing combinations of heterozygous mice

不同基因型小鼠進(jìn)行親本自交時(shí)繁殖情況如表4所示。受測(cè)純合子雌小鼠20只,受孕4只,受孕率為20%,分娩雌小鼠2只,分娩率為10%,且分娩的2只純合子雌小鼠和子代小鼠均死亡,子代小鼠存活率為0%。野生型小鼠作為親本自交,得到15胎,共128只小鼠,平均每胎9只。雜合子(HE)自交繁殖得到19胎,共109只,平均每胎6只。受測(cè)雜合子和野生型雌小鼠分別為15只和19只,受孕率、分娩率和子代小鼠存活率都為100%。上述結(jié)果表明,純合子雌小鼠很難受孕,即使受孕也很難生出小鼠或者生出不完整的小鼠即死胎,此時(shí)純合子小鼠往往難產(chǎn)而死。而雜合子和野生型小鼠均能正常受孕和分娩。表明β4GalT1基因點(diǎn)突變影響了雌小鼠的繁殖能力。

表4 不同基因型小鼠自交繁殖情況Table 4 Reproduction of self-crossing of different genotypes of mice

如圖5所示:純合子、雜合子和野生型小鼠自交后得到的平均每胎子代數(shù)量分別為0、(6±2)和(9±2)只。野生型自交所得到的平均每胎子代小鼠數(shù)量極顯著多于雜合子自交及純合子自交所得到的子代小鼠數(shù)量(P<0.01)。說明β4GalT1基因點(diǎn)突變對(duì)雌小鼠的生殖有影響。

3 討論與結(jié)論

糖基化修飾是生物體中一類重要的轉(zhuǎn)化反應(yīng),可以把糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到糖基受體,從而形成各種聚糖、糖蛋白和糖脂等過程的反應(yīng)[25-26],與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育等各項(xiàng)活動(dòng)都密切相關(guān)。β4GalT是一種重要的糖基轉(zhuǎn)移酶,廣泛分布在人體內(nèi)各個(gè)組織中,β4GalT1是糖基轉(zhuǎn)移酶家族β4GalT中的一員。Asano等[13]研究β4GalT1基因敲除對(duì)小鼠生理功能的影響發(fā)現(xiàn),敲除小鼠可以正常出生和被繁殖,但是生長(zhǎng)遲緩,以及表現(xiàn)為斷奶前的半數(shù)致死性等。本試驗(yàn)通過研究β4GalT1基因點(diǎn)突變(β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1轉(zhuǎn)變?yōu)棣?1,4-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶)小鼠模型(由基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9構(gòu)建),探究β4GalT1點(diǎn)突變后小鼠在生長(zhǎng)發(fā)育、行為能力及繁殖過程等方面的變化。

通過對(duì)β4GalT1基因點(diǎn)突變純合子小鼠和野生型小鼠肝中的N-鏈寡糖的UPLC峰譜圖分析可知,兩者的峰譜圖有很大差異。β4GalT1基因點(diǎn)突變以后,由于缺少β4GalT1,導(dǎo)致純合子小鼠體內(nèi)N-鏈寡糖中半乳糖合成減少,進(jìn)而影響N-鏈寡糖的唾液酸化。因此,純合子小鼠肝中N-鏈寡糖的UPLC峰譜圖中的峰型前移,證明β4GalT1基因點(diǎn)突變?yōu)棣?GalNAcT1以后,改變了小鼠肝中N-鏈寡糖的結(jié)構(gòu)。這種突變導(dǎo)致小鼠其他器官和組織中的蛋白質(zhì)N-糖基化也發(fā)生了變化,基于蛋白質(zhì)N-糖基化的重要生物學(xué)功能,純合子小鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)N-糖基化的改變必然也改變小鼠的生理機(jī)能。

通過對(duì)β4GalT1基因點(diǎn)突變純合子小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況記錄并分析,發(fā)現(xiàn)純合子小鼠在斷奶前的存活率為90%,而野生型小鼠在斷奶前的存活率為100%,表明β4GalT1基因點(diǎn)突變降低了小鼠的存活率。β4GalT1基因敲除導(dǎo)致小鼠斷奶前半數(shù)致死[3],而本研究中β4GalT1基因點(diǎn)突變純合子小鼠斷奶前存活率顯著高于β4GalT1基因敲除小鼠,由此說明β4GalT1基因點(diǎn)突變比敲除對(duì)小鼠存活率影響更小。比較純合子和野生型小鼠體質(zhì)量,發(fā)現(xiàn)它們?cè)谏L(zhǎng)發(fā)育期間體質(zhì)量無顯著差別(P>0.05)。對(duì)比純合子和野生型小鼠各器官質(zhì)量,發(fā)現(xiàn)心臟、肝臟、腸等器官的質(zhì)量在2種小鼠中沒有顯著差異,說明β4GalT1突變?yōu)棣?GalNAcT對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育過程沒有顯著影響。

Shen 等[22]發(fā)現(xiàn)β4GalT1可能參與了受損的外周神經(jīng)早期損傷階段的再生,PC12細(xì)胞中的β4GalT1過度表達(dá)顯著增強(qiáng)了軸突的形成和延伸[20,27]。這些研究表明,β4GalT1與小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。本研究通過對(duì)純合子、野生型小鼠日常狀態(tài)的觀察記錄及小鼠懸尾試驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)純合子小鼠較野生型小鼠而言,表現(xiàn)為反應(yīng)遲滯,對(duì)外界刺激反應(yīng)不敏感等癥狀。懸尾試驗(yàn)顯示純合子小鼠掙扎較輕,純合子小鼠的靜止時(shí)間顯著長(zhǎng)于野生型小鼠(P<0.01),說明純合子小鼠處于抑郁狀態(tài)的時(shí)間更長(zhǎng),證明β4GalT1基因通過表達(dá)β4GalT1從而參與小鼠體內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。而突變體β4GalNAcT并不能補(bǔ)償β4GalT1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中所起的重要作用。

已有研究報(bào)道,β4GalT1與小鼠受精過程密切相關(guān)。Rodeheffer等[17]研究結(jié)果表明精子通過β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(精子表面的凝集素樣受體)識(shí)別并與透明帶糖蛋白ZP3內(nèi)的特定寡糖配體結(jié)合,從而影響小鼠的精卵識(shí)別。β4GalT1的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以直接或間接結(jié)合被ZP3激活的異源三聚體G蛋白,最終使得精子與卵子結(jié)合成為受精卵,發(fā)育成胚胎,從而影響小鼠的胚胎發(fā)育。純合子與純合子交配時(shí),雌小鼠受孕困難,說明β4GalT1與小鼠的精卵識(shí)別密切相關(guān),另外,雌小鼠卵子的透明糖蛋白ZP3內(nèi)的特定寡糖配體結(jié)構(gòu)也可能發(fā)生變化,并進(jìn)一步影響精卵的識(shí)別與結(jié)合。因此,β4GalNAcT突變體雖然也能使雌小鼠受孕,但與β4GalT1相比,精卵識(shí)別與結(jié)合的能力大大降低。純合子與純合子交配時(shí),雌小鼠受孕以后很難生出子代小鼠,甚至純合子雌小鼠難產(chǎn)死亡,說明β4GalT1對(duì)雌小鼠的繁殖能力也有著至關(guān)重要的作用,突變后無法維持雌小鼠的正常懷孕和生產(chǎn),其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。此外,雜合子小鼠的自交繁殖結(jié)果表明,純合子、雜合子、野生型小鼠的基因型比例約為1∶4∶2,子代純合子小鼠所占比例明顯少于孟德爾遺傳定律所應(yīng)占比例(1∶2∶1)。純合子、雜合子、野生型小鼠的自交繁殖結(jié)果表明,純合子小鼠自交平均每胎子代數(shù)顯著少于雜合子和野生型小鼠(P<0.01)。以上結(jié)果表明β4GalT1基因點(diǎn)突變?cè)诙鄠€(gè)方面都降低了純合子小鼠的出生率和繁殖能力,這說明β4GalT1可以通過影響小鼠的精子識(shí)別和胚胎的發(fā)育,從而影響小鼠的整體繁殖能力。因?yàn)楸驹囼?yàn)中未能獲得純合子雌小鼠的母乳(母鼠與子鼠均死亡),因此也無法獲得不含乳糖的乳,也因此,通過將β4GalT1基因改造成β4GalNAcT1而生產(chǎn)不含有乳糖的乳的設(shè)想未成功。

肝臟作為人體最大的腺體,參與膽汁的分泌、解毒、吞噬、代謝、排泄以及免疫等多種復(fù)雜的生物學(xué)過程[25]。β4GalT1突變后導(dǎo)致小鼠N-鏈寡糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了變化,從而引起生理功能(如:生長(zhǎng)發(fā)育、行為能力及繁殖能力等)的改變,而N-鏈寡糖結(jié)構(gòu)的改變與小鼠生理功能變化的具體聯(lián)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。