周希梅，趙 華，黃萌萌，李競前，閆奎友

全國畜牧總站，北京 100125

0 引言

凝乳酶（Chymosin）對奶酪生產(chǎn)至關(guān)重要。早在公元3—4世紀，人類就偶然發(fā)現(xiàn)動物胃中某種成分可使乳凝固，這是人們認識凝乳酶的伊始[1]。隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展，制作奶酪用的工業(yè)化商品凝乳酶已經(jīng)取得了許多突破，但在國內(nèi)家庭牧場和羊乳企業(yè)小規(guī)模生產(chǎn)制作奶酪上，凝乳酶的傳統(tǒng)提取方法仍是解決其來源的最為簡單易行的核心關(guān)鍵技術(shù)。

1 凝乳酶種類及作用機理

1.1 種類

根據(jù)凝乳酶來源的不同，可以分為動物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶、遺傳工程凝乳酶四大類。

1.1.1 動物凝乳酶

在傳統(tǒng)意義上，動物凝乳酶一般是指從多胃反芻動物（犢牛、羔羊等）的第四胃（皺胃）提取出來的，可使乳凝固的酶制品——皺胃酶（Rennet），有時也稱“天然動物酶”。皺胃酶的主要成分是凝乳酶、胃蛋白酶（Pepsin）等，均歸類于天冬氨酸肽酶，除此之外，還含少量多肽、核苷、含氮堿基、氨基酸、甘油和脂肪酸等。

小牛皺胃中的凝乳酶占比高達90%。經(jīng)提取后，皺胃酶中的凝乳酶占比為50%～80%。凝乳酶能特異性水解κ-酪蛋白產(chǎn)生酪蛋白巨肽，近而形成凝乳，而胃蛋白酶的水解特異性并不專一，可同時水解含苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、蘇氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）的肽鍵。

豬胃蛋白酶比小牛胃蛋白酶更接近小牛皺胃酶，但因其穩(wěn)定性差，易受熱鈍化失活，單獨使用活性低，對奶酪成熟中的蛋白質(zhì)降解貢獻極小，使奶酪成熟變得非常慢，組織狀態(tài)也差。當豬胃蛋白酶與粗制的皺胃酶混合使用時，總體效果可接受，能替代一部分皺胃酶。

駱駝有3 個胃（無瓣胃），駝胃的凝乳酶具有特殊的κ-酪蛋白水解活力，優(yōu)于小牛皺胃酶。用駝胃的凝乳酶制作奶酪時，非特異性降解蛋白損失少，奶酪產(chǎn)出率高，且苦味少，制成復合凝乳酶制劑，可達到或超過小牛皺胃酶的凝乳效果。水牛胃的凝乳酶穩(wěn)定性和活性與小牛皺胃酶截然不同，其凝乳具有獨特的專一性，僅適合水牛乳奶酪的生產(chǎn)。

1.1.2 植物凝乳酶

自然界的許多植物都含蛋白酶。從其中提取汁液，進行凝乳酶研究的包括木瓜、蓖麻籽油、無花果、菠蘿等的蛋白酶。截至目前，已經(jīng)從各類樹木中提取出40 多種能夠凝乳的酶，但它們水解速度過快，會過度水解蛋白質(zhì)而產(chǎn)生苦味肽，影響風味和凝乳，因此，僅適于成熟需要幾天的軟質(zhì)奶酪，而不適于需要長時間成熟的硬質(zhì)奶酪。

從木瓜提取的木瓜蛋白酶可使牛乳和羊乳凝固，其特點為蛋白質(zhì)分解力強，脂肪損失小，奶酪成品得率高，但制成的奶酪?guī)в忻黠@的苦味，很難推廣，只能用于生產(chǎn)某些新鮮奶酪、稀奶油奶酪以及只需要短期發(fā)酵的軟質(zhì)奶酪，如細菌發(fā)酵成熟的手工奶酪和霉菌發(fā)酵成熟的卡門貝爾奶酪等。

新鮮無花果汁經(jīng)結(jié)晶分離，能成功提取無花果蛋白酶，可用其制作半硬質(zhì)奶酪，凝乳與成熟的效果都較好，但對蛋白質(zhì)分解力較強，脂肪損失多，奶酪成品得率低，且有苦味。

目前只有白花牛角瓜（Calotropis procera L）、碎米芥（Cardamine hirsuta L.）、捕蟲堇（Pinguicula alpina L.）、蓬子菜（Galium verum L.）及薊屬（Cynara L.）等植物酶被認為比較適合制作各種奶酪。其中薊屬植物中的刺菜薊和菜薊非常適合生產(chǎn)以綿羊乳和山羊乳為原料的奶酪，國外應用比較多。

1.1.3 微生物凝乳酶

來源于傳統(tǒng)意義上的凝乳酶數(shù)量有限，不能滿足奶酪生產(chǎn)需求。20世紀60年代，微生物凝乳酶開始應用，最為成功的是米黑毛霉（Mucor miehei）和微小毛霉（Mucor pusillus）凝乳酶，但用其生產(chǎn)的奶酪成品得率較低，成熟后風味不夠理想，容易因發(fā)酵過度而造成奶酪質(zhì)地不佳。

1.1.4 基因工程凝乳酶

隨著基因工程技術(shù)不斷發(fā)展，使凝乳酶基因在微生物宿主進行表達成為現(xiàn)實。目前全球大多數(shù)凝乳酶都是借助微生物生產(chǎn)的，大致分成霉菌、細菌、擔子菌三種來源。其中應用最多的是源于霉菌的凝乳酶。微生物凝乳酶制作周期短、產(chǎn)量高，不受自然地域的限制，制造成本低，酶純度高。

基因工程凝乳酶已成功應用于凝乳酶的批量生產(chǎn)，大大緩解了傳統(tǒng)動物凝乳酶的供應不足?；蚬こ棠槊概c天然動物皺胃酶幾乎一致，對酪蛋白水解活力非常相似，且已獲得安全性認定，在許多國家得到廣泛應用。

近些年，人們通過克隆山羊凝乳酶原cDNA，使其在酵母中進行表達，所生成的cDNA編碼序列與山羊凝乳酶原的基因編碼具有高度相似性。正是由于克隆山羊凝乳酶所表現(xiàn)出的對κ-酪蛋白的高度特異性，因此，使其廣泛運用于山羊奶酪的制作。人工克隆綿羊凝乳酶原的cDNA在大腸桿菌中進行表達凝乳效果和成品品質(zhì)均與羔羊皺胃酶非常類似。

1.2 凝乳酶作用機理

在奶酪生產(chǎn)中，凝乳的方法歸納起來主要有4 種。一是酶法凝乳。凝乳酶可以使κ-酪蛋白不穩(wěn)定，在鈣離子參與下發(fā)生聚合；二是酸法凝乳，酸化而引發(fā)的凝乳，凝乳的溫度通常為60~80 ℃；三是熱誘導凝乳，主要發(fā)生在乳被高溫加熱的情況；四是加鹽與加熱共同作用的凝乳，如我國廣東等南方地區(qū)的乳餅（Milk Cake）[2]、意大利里科塔（Ricotta）奶酪等。在這四種凝乳方法中，第一種酶法凝乳是全世界奶酪制作應用最為廣泛的，也是本部分論述的重點。

1.2.1 凝乳酶的凝乳過程

乳中酪蛋白不穩(wěn)定，可以在一定條件下凝聚而凝固，是制作奶酪的基本前提，凝乳則是奶酪生產(chǎn)中至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)。

乳中酪蛋白約90%以微團狀態(tài)存在，稱為酪蛋白膠束，均勻分散在乳中，構(gòu)成酪蛋白膠體系。酪蛋白膠束中的κ-酪蛋白是以低聚物形式存在的，約6 個分子組成，分布于膠束表面。κ-酪蛋白分子的親水C-末端從膠束內(nèi)部以柔韌“發(fā)層”伸向液相，具有極強的自由度，“發(fā)層”厚度約7 nm。C-末端始于殘基86、96位處，凝乳酶分解苯丙氨酸、甲硫氨酸（Phe-Met）鍵位于殘基的105、106位。酪蛋白膠束表面“發(fā)層”架構(gòu)形成位阻空間，使膠束穩(wěn)定在乳中。

酶凝固，首先始于酪蛋白酶水解，凝乳酶對κ-酪蛋白的作用點位于κ-酪蛋白的N-末端105位的苯丙氨酸與106位的蛋氨酸的肽鍵結(jié)合處，因酶作用而裂成2 個片段，N-末端側(cè)的，稱副κ-酪蛋白，而C-末端側(cè)的，稱酪蛋白巨肽。前者疏水性高、不溶于水，后者親水性高并含糖[2]。

κ-酪蛋白水解度達到一定程度時，水解位點又相互結(jié)合，發(fā)生副酪蛋白的聚合，隨著線形鏈的生成，增強了乳黏度，進而加劇相互交聯(lián)而成網(wǎng)構(gòu)狀，液體介質(zhì)充滿網(wǎng)構(gòu)間隙中，誘發(fā)液膠-凝膠的轉(zhuǎn)變（Sol-Gel Translation），乳由黏性流體，變成黏彈性的固體。隨著酪蛋白結(jié)構(gòu)重排，借助乳中的游離鈣離子，促成了更多交聯(lián)鍵，稱“鈣橋”，隨著凝塊漸厚，最終發(fā)生膠凝化凝固，膠體脫水收縮，至乳清析出。

1.2.2 羊乳的酶凝固

羊乳，其凝乳酶的凝乳過程與前文所述基本一致。通常，羔羊凝乳酶凝固羊乳的效率較高，但羊乳的pH、溫度會直接影響酶凝乳的效果，為了進一步提高凝乳效率，在加入羔羊凝乳酶之前，還需增加兩個重要輔助手段，即加入乳酸菌發(fā)酵劑控制乳的酸度和通過加熱保溫設備控制凝乳的溫度。

副酪蛋白聚合階段對乳的溫度很敏感，主要蛋白質(zhì)的分解階段發(fā)生在pH5.20～5.80范圍。在凝乳酶、發(fā)酵劑的共同作用下，乳蛋白質(zhì)被降解成肽類，對促進奶酪后期成熟極其關(guān)鍵，肽類被微生物進一步利用或降解，便產(chǎn)生奶酪的特殊風味和滋味。

當乳pH為4.6，即酪蛋白等電點，在溫度為20 ℃時，所得到的蛋白質(zhì)即為酪蛋白，構(gòu)成奶酪的主要蛋白質(zhì)。與其他哺乳動物一樣，羊乳的酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白組成。酪蛋白屬兩性電解質(zhì)，在乳中以酪蛋白酸鈣與磷酸鈣的復合形態(tài)存在，對pH高低非常敏感，尤其等電點高于其他蛋白的β-酪蛋白。當pH降至等電點以下，鈣離子和β-酪蛋白從膠束中被釋放，因β-酪蛋白帶正電荷，其他蛋白帶負電荷，便引發(fā)蛋白質(zhì)相互吸引，最終形成蛋白質(zhì)凝固與沉淀。

2 羔羊凝乳酶自制方法

哺乳期小羔羊胃主要分泌的消化酶是皺胃酶。當飼喂母羊乳汁以外的飼料時，其胃就開始分泌胃蛋白酶，隨著月齡增大，胃蛋白酶比例逐步增加，而皺胃酶逐漸減少。因此，自制提取羔羊皺胃酶時，應選用正處于哺乳期的小山羊或小綿羊的第四胃（皺胃），所得羔羊皺胃酶含量和活力能夠達到最佳。

2.1 羔羊皺胃的處理

挑選健康的0～4 周齡羔羊，宰前10 h停止飼喂。宰后立即切取皺胃。由于皺胃的上半部分所分泌的酶數(shù)量最多，應從第三胃（瓣胃）的末端處切取，而下部分也應從第四胃（皺胃）十二直腸的上部分切斷（圖1），確保不損失有效皺胃酶成分。

圖1 皺胃切取示意圖[3]

以潔凈的流水，沖洗皺胃，去除胃內(nèi)殘留物，并剔凈脂肪與結(jié)締組織，放置在-18 ℃條件下進行冷凍備用。當提取凝乳酶時，要記錄本批次所用皺胃的個數(shù)，并對皺胃統(tǒng)一進行混合及充分粉碎，確保處理混勻，完全制成肉糜狀。

2.2 操作步驟

用食鹽酒精混合液浸泡肉糜。其中，食鹽濃度4%～5%，酒精濃度10%～12%。具體操作步驟如下。

2.2.1 浸泡保存

按每個羔羊皺胃需用食鹽酒精液200 mL的用量，對肉糜進行充分浸泡，并置于陰暗且避光處保存5 d。注意每天應進行2 次以上的充分攪拌。

2.2.2 離心處理

至第6 d時，小心收集上清液，將下部分的渾濁體與殘渣，用離心機實施進一步分離，所得的液體，再與上清液混合一處，得到浸出液。注意保留分離的殘渣。

2.2.3 浸泡殘渣

按每個皺胃用2.2.2得到的浸出液100 mL的比例用量，回加入已分離的殘渣中，攪拌并置陰暗避光處，再浸泡2 d時間后，以2.2.2同樣的方式，再提取而成浸出液。

2.2.4 澄清處理

將步驟2.2.2和2.2.3的浸出液，全部混合一處，置于潔凈的玻璃容器內(nèi)，按5%的比例，慢慢加入濃度1 mol/L的鹽酸并攪拌，靜止5～10 min，原來渾濁的浸出液開始出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，浸出液主體逐漸變得較為清澈，少量黏性物質(zhì)形成沉淀物，沉于容器底部。

2.2.5 鹽度與pH值

分離剔除沉淀物后，按一定比例向浸出液中再加入食鹽，使浸出液的含鹽控制在約15%。再將浸出液的pH調(diào)整至5～6，即為液體羔羊凝乳酶。置2～6 ℃陰暗避光處保存。測定活力后，隨時可以用于羊奶酪的生產(chǎn)。

上述全程操作可在常溫下進行。有條件時，也可采用升華干燥法將液體凝乳酶制成粉末狀，以方便貯存和運輸。

2.3 注意事項

因為羔羊個體差異以及月齡不同，每個批次的羔羊皺胃浸提液中的凝乳酶與胃蛋白酶可能含量有所不同，為此，可將不同批次制得的浸提液，混合在一起，并用蒸餾水統(tǒng)一稀釋到一定的濃度，備用于生產(chǎn)。這樣做的目的，是為預防因不同批次制得的浸提液酶濃度不一（過高或過低）而引發(fā)羊乳的凝固不均勻，導致不同批次羊奶酪的品質(zhì)（質(zhì)地結(jié)構(gòu)）出現(xiàn)差異，影響產(chǎn)品質(zhì)量。

混合浸提液的稀釋倍數(shù)，可根據(jù)浸提液存放時間和所測得的活力而定。通常情況下，1 個羔羊皺胃所自制成的凝乳酶，能凝固羊乳1 200~1 500 L。

3 羔羊凝乳酶活力測定

掌控凝乳酶活力的強弱，是羊奶酪生產(chǎn)中非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。供應商提供的商品凝乳酶，可按供應商提供的應用技術(shù)說明方法使用，一般按批次包裝進行一次凝乳酶活力測試，做好記錄標識。

同樣，針對自制的羔羊凝乳酶，須按凝乳酶制作批次進行活力測定。按照每批次生產(chǎn)羊奶酪所用羊乳的重量，生產(chǎn)操作人員應準確計算和量取凝乳酶的用量。在實際生產(chǎn)中，通常用凝乳槽（罐）一次所能容納的羊乳重量，作為計算依據(jù)。出于操作簡單和生產(chǎn)效率，注意應做到每次凝乳槽（罐）均保證是恒定的羊乳重量。

3.1 凝乳酶活力

凝乳酶活力，一般是指100 mL的1%凝乳酶溶液（或1 g凝乳酶干粉），在固定溫度下（35 ℃）和固定時間內(nèi)（40 min），能夠凝固羊乳的毫升數(shù)（mL）。

為方便生產(chǎn)一線操作人員進行凝乳酶活力測定，準確管控凝乳酶用量，下面介紹一種簡單實用的凝乳酶具體用量的計算方法。

3.2 測定活力步驟

設施與試劑主要有粗天平、溫度計、100 mL量筒、漏斗、普通濾紙、玻璃棒、150～200 mL燒杯、150 mL三角燒瓶、蒸餾水等。為方便表述，現(xiàn)以羔羊皺胃酶干粉為例。測定方法如下。

3.2.1 配制1%凝乳酶溶液

稱取1 g的凝乳酶干粉，置放于150 mL三角瓶內(nèi)，加入100 mL35 ℃的蒸餾水。充分混溶后，確保靜止15 min后過濾，保留濾液。提示：配制好的酶溶液，應在2 h之內(nèi)完成活力測定。

3.2.2 記錄開始凝乳時間

用量筒量取100 mL羊乳（供試乳，需取自用來制作羊奶酪的同一批次原料乳）置放于150～200 mL的燒杯內(nèi)，通過水浴加熱到35 ℃后，再加1 mL已配制好的1%酶溶液，并立即以玻璃棒用同方向進行攪拌，同時，記下開始時間（min）。

3.2.3 記錄羊乳凝固時間

以玻璃棒，用同方向進行攪拌羊乳后，取出玻璃棒，立即在羊乳的表面上置一個小片紙屑（或木炭顆粒），以此來觀察羊乳凝固狀態(tài)。當紙屑（或木炭顆粒）停止轉(zhuǎn)動時，即表明羊乳已凝固，記下此刻的時間（min）。前后的時間差即為凝乳時間（min）。

3.3 凝乳酶活力計算

3.3.1 計算演示

如100 mL的1%羔羊凝乳酶溶液，在9 min內(nèi)，使100 mL的羊乳發(fā)生凝固，則該羔羊凝乳酶的活力為：

3.3.2 結(jié)果應用

100 mL1%的羔羊凝乳酶溶液（或1 g凝乳酶粉），能使44 000 mL的羊乳凝固。生產(chǎn)制造羊奶酪時，就可按此比例，再計算出應加入到羊乳中的凝乳酶用量。

4 小結(jié)

本文通過簡析凝乳酶凝乳原理并結(jié)合羊乳的凝乳條件和特點，重點介紹了自行提取制備羔羊凝乳酶的技術(shù)方法。其中，羔羊皺胃選取與處理、充分浸泡和離心處理，以及浸出液鹽度與pH值調(diào)整至關(guān)重要，直接影響羊乳凝乳效果和羊奶酪成品產(chǎn)出率，須嚴格管控操作步驟和重要技術(shù)參數(shù)。