牟泓羽，李 媛，余智瑾，趙存朝，彭 磊

1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201

2 昆明生物制造研究院有限公司，云南昆明 650201

3 云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南昆明 650201

4 云南省特色資源食品生物制造工程研究中心，云南昆明 650201

0 引言

奶啤是一種以牛奶和小麥為主要原料，經(jīng)乳酸菌和酵母發(fā)酵而成的低酒精乳飲料，其風(fēng)味獨(dú)特，還富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1~3]。近年來，隨著消費(fèi)水平的提升以及大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展多糖食品引起肥胖、齲齒和影響鈣吸收[4，5]的問題得到普遍重視，消費(fèi)者越來越傾向于低糖的消費(fèi)習(xí)慣，對低糖食品的需求量越來越大。為滿足多樣的消費(fèi)市場，市面上已經(jīng)出現(xiàn)了大量無糖類食品[6]，但還未出現(xiàn)無糖奶啤的產(chǎn)品。木糖醇的熱量是蔗糖的60%，并且木糖醇不需要胰島素來參與代謝，不會升高血糖，還有保肝護(hù)肝等功能[7，8]。本研究在前人奶啤生產(chǎn)工藝、配方、發(fā)酵菌株等方面研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化[9~12]，首創(chuàng)以木糖醇代替蔗糖的一款無糖特色奶啤，研制出的無糖奶啤營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、口感良好，豐富了乳飲料的種類。

1 試驗與方法

1.1材料

鮮牛乳，優(yōu)牧品源有限公司；小麥、薩茲啤酒花、卡斯卡特啤酒花、艾爾酵母，煙臺帝伯仕自釀機(jī)有限公司；木糖醇，南京甘汁園糖業(yè)有限公司；保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌，帝斯曼公司；酚酞，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NaOH、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅溴甲酚綠指示劑，天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司；硫酸、硼酸，川東化工有限公司；三氯蔗糖，山東萍聚生物科技有限公司：復(fù)配乳化增稠劑，丹尼斯克（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HJJ-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；WT20002電子天平，杭州萬特衡器有限公司；WT20002高壓均質(zhì)機(jī)，杭州萬特衡器有限公司：粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；pH計，上海越平儀器有限公司；DPX-9162B-1恒溫培養(yǎng)箱，上海福瑪試驗設(shè)備有限公司；ATN-300型全自動凱式定氮儀，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1 工藝流程

工藝流程圖見圖1。

圖 1 工藝流程圖

1.3.2 操作要點(diǎn)（1）發(fā)酵乳的制備：鮮牛乳預(yù)熱，添加10%木糖醇后均質(zhì)，滅菌冷卻后在溫度37~42 ℃時加入1‰嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、乳酸菌，將其移至恒溫培養(yǎng)箱中于42 ℃的溫度發(fā)酵5 h，酸奶剛凝固時移至冰箱冷卻后熟12 h取出，常溫破乳，冷藏備用。

（2）糖化：將粉碎好的麥芽加入約50 ℃的恒溫水浴鍋中，先將其在52 ℃加熱20 min，再65 ℃加熱30 min；然后將溫度調(diào)整到78 ℃加熱10min，完成糖化。

（3）麥汁煮沸和酒花添加：煮沸5 min后按添加0.2 g/L卡斯卡特啤酒花，煮沸30 min，再添加0.2 g/L薩茲啤酒花，煮沸45 min。

（4）小麥啤酒發(fā)酵：添加0.2%艾爾酵母，20 ℃發(fā)酵5 天，啤酒中二氧化碳?xì)馀轀p少，析出物增多，液面覆有一層淺色蓋泡，停止發(fā)酵。

（5）啤酒原液與發(fā)酵乳后酵（二次發(fā)酵）：啤酒原液與發(fā)酵乳按照5∶1的比例混合，在28 ℃下二次發(fā)酵10 h。

（6）添加復(fù)配增稠劑、均質(zhì)：發(fā)酵液中添加5%木糖醇，0.3%復(fù)配乳化增稠劑，并在20 Mpa條件下均質(zhì)兩次。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

以感官評分為主要指標(biāo)，探究考察啤酒原液與發(fā)酵乳的體積比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1）；后酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）；后酵時間（6 h、8 h、10 h、12 h、14 h）；木糖醇添加量（3%、4%、5%、6%、7%）；復(fù)配乳化增稠劑（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）等因素對奶啤感官品質(zhì)及滴定酸度的影響。在單因素基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面對奶啤的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化

采用單因素試驗結(jié)果，利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計試驗，以啤酒原液與發(fā)酵乳的體積比、后酵溫度、后酵時間作為試驗因素，感官評分作為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的試驗設(shè)計，并挑選出最適合的試驗數(shù)據(jù)。響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken 因素水平表

1.3.5 感官評分

無糖奶啤感官評定參照《Q/EMYR 0002 S-2020 發(fā)酵型奶啤酒》和《Q/NXDY 0001 S-2019奶?。ㄈ樗峋嬃希分械南嚓P(guān)方法進(jìn)行評定，分別從色澤（25分），口感（30分），風(fēng)味（25分），組織狀態(tài)（20分）4 個方面進(jìn)行無糖奶啤的感官評定。組織10 位具有一定專業(yè)知識的人員經(jīng)培訓(xùn)組成感官評定小組對本次研究所做的奶啤進(jìn)行打分及綜合評價。

表2 無糖奶啤感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.6 奶啤理化測定

酒精度的測定：采用《GB/T4928—2001啤酒分析方法》中的蒸餾法；酸度的測定：《GB5009.239—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品 酸度的測定》中的酚酞指示劑法；蛋白質(zhì)的測定：采用《GB 5009.5—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法。

1.3.7 微生物測定

大腸桿菌的檢測參照《GB4789.3—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)；金黃色葡萄球菌的檢測參照《GB 4789.10—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》中的平板計數(shù)法；菌落總數(shù)參照《GB 4789.2—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》；沙門氏菌的檢測參照《GB 4789.4—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》；霉菌的檢測參照《GB 4789.15—2016食晶安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食晶微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2019對單因素的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和整理，采用SPSS21.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

如圖1所示，隨著啤酒原漿與發(fā)酵乳的體積比增大，奶啤的感官評分呈先升高后下降的趨勢，啤酒與酸奶的比例在3∶1時，奶啤的酒味不足，奶酸味較重，且有一些絮凝物[13]，在啤酒與酸奶的體積比為5∶1時感官評分達(dá)到最高值，奶啤的風(fēng)味有濃郁的發(fā)酵乳香和啤酒香、色澤均勻、色澤呈乳白色，乳香較適宜，酒香宜人，隨后感官評價呈現(xiàn)下降趨勢，隨著啤酒的添加量增加，奶啤的酒味過重，奶味不足，酒精度數(shù)也逐漸增加，且顏色偏褐色。因此，綜合考慮，選擇啤酒與酸奶的體積比為5∶1。

隨著發(fā)酵溫度的增加，奶啤的感官評價先上升后下降。在28 ℃發(fā)酵條件下，風(fēng)味協(xié)調(diào)，甜味較適中，在這個溫度下，感官得分最高。隨著溫度升高，滴定酸度也隨之增加，在32 ℃時酸度達(dá)到69.16 °T，此時酸味較重，成品偏酸，且溫度過高易造成雜菌污染[14]。因此，綜合考慮，選擇后酵溫度為28 ℃。

發(fā)酵時間低于10 h時，發(fā)酵時間短，后發(fā)酵不充分，奶啤特有的酒香味和乳味不夠明顯，當(dāng)發(fā)酵溫度時間至10 h時，酒味及乳味協(xié)調(diào)，酸度和甜度較為適宜，感官評分最高。發(fā)酵時間超過10 h時，滴定酸度不斷增加，導(dǎo)致成品的酸度太高，會有較明顯的酸味和酵母味，口感粗糙且風(fēng)味差。因此，綜合考慮，選擇后酵時間為10 h。

由圖1可以看出，木糖醇的添加量5%，復(fù)配乳化增稠劑的添加量0.3%時，感官評價最好，在此條件下的成品，甜味適中，組織形態(tài)最好，具有很好的穩(wěn)定性[15]。

圖1 不同因素對產(chǎn)品感官評價的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化與結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)優(yōu)化及結(jié)果

基于Box-Behnken設(shè)計，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 軟件進(jìn)行分析，選取啤酒原液與發(fā)酵乳體積比、后酵溫度、后酵時間3 個因素進(jìn)行分析，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

2.2.2 模型的建立及顯著的性檢驗

響應(yīng)曲面法的試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，設(shè)啤酒與酸奶體積比、二次發(fā)酵溫度和二次發(fā)酵時間分別為A、B、C，以感官評分為響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表4，得到二次多項回歸模型：Y=90.29+0.95A+2.17B+1.92C-1.36AB+0.71AC+1.34BC-3.15A2-4.49B2-3.63C2。

進(jìn)一步對該模型及回歸系數(shù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表4，從表4可以看出該回歸模型P<0.0001（極顯著），其失擬項P=0.27090.05（不顯著），說明模型擬合程度良好，可以對回歸方程相應(yīng)回歸值進(jìn)行預(yù)測，同時模型回歸系數(shù)R2=0.9855，調(diào)節(jié)后的R2=0.9668（大于0.8000），表明96.68%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋，這說明該模型能很好地解釋這一模型。通過分析相關(guān)數(shù)據(jù)可以看出，一次項后酵溫度、后酵時間對感官評分具有極顯著影響（P<0.01），啤酒原液與發(fā)酵乳體積比對感官評分具有顯著影響（P<0.05），分析各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：B>C>A，即后酵溫度>后酵時間>啤酒原液與發(fā)酵乳體積比。其二次項交互作用BC、AB對感官評分具有極顯著的影響（P<0.05），AC對感官評分的影響不顯著（P>0.05），且二次項交互作用對感官評分影響大小程度為BC>AB>AC。

表4 回歸模型方差分析表

2.2.3 驗證試驗結(jié)果

根據(jù)回歸方程模型，得到預(yù)測的最優(yōu)條件為：啤酒原液與發(fā)酵乳體積比為5.129、后酵溫度為28.541 ℃、后酵時間為10.654 h，根據(jù)試驗實(shí)際條件，將條件修正為啤酒原液與發(fā)酵乳體積比5.1∶1、后酵溫度為28.5 ℃、后酵時間為10.7 h，在此最優(yōu)條件下經(jīng)3 次平行試驗實(shí)際感官評分為91分，與預(yù)測值總感官評分為90.954分相差在5%范圍內(nèi)，證實(shí)了預(yù)測值和試驗值之間的良好相關(guān)性。

表5 最佳條件的確定和回歸模型驗證

2.3 無糖奶啤的理化和微生物檢測結(jié)果

經(jīng)檢測，無糖奶啤的蛋白質(zhì)含量為0.9%，可溶性固形物8.9%，酸度為55°T，未檢測出有害菌，菌落總數(shù)再規(guī)定范圍內(nèi)，酒精度為1.212%，理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，是一款口感風(fēng)味良好，安全健康的產(chǎn)品。

表6 理化衛(wèi)生指標(biāo)結(jié)果

3 結(jié)論

無糖奶啤是以鮮牛奶、麥芽、酒花為主要原料，利用以木糖醇替代蔗糖通過二次生物發(fā)酵技術(shù)釀制的一種高附加值，低醇的乳制飲品。通過單因素和響應(yīng)面試驗確定最佳工藝為：小麥料液比為1∶5（kg/L），將麥芽料液進(jìn)行糖化、過濾、麥芽汁煮沸后，投入0.2 g/L卡斯卡特啤酒花、添加0.2 g/L捷克薩茲啤酒花煮沸45 min，將0.2%的艾爾酵母液添加在過濾冷卻的麥汁中，20 ℃的條件下發(fā)酵5 天，然后與發(fā)酵乳（5∶1）混合，在28 ℃下后酵10 h后過濾，加入1‰的三氯蔗糖、5%木糖醇、0.3%復(fù)配乳化增稠劑，20 Mpa均質(zhì)兩次，滅菌后得到成品。通過對無糖奶啤飲料的蛋白質(zhì)，可溶性固形物，滴定酸度，大腸桿菌，細(xì)菌總數(shù)，酒精度等方面進(jìn)行檢測，均符合要求。