周兵，王潔，彭麗姿，張劍鋒

(1.九江市第一人民醫(yī)院，江西 九江 332000；2.江西省腫瘤醫(yī)院，江西 南昌 330029)

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)研究的深入和基因測(cè)序工作的廣泛開(kāi)展，腫瘤治療邁入到精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，研究證實(shí)可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和干擾細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生[1]。針對(duì)性的肺腺癌驅(qū)動(dòng)基因突變靶點(diǎn)的藥物治療，相對(duì)于傳統(tǒng)化療藥物，不僅具有作用精準(zhǔn)、效用好等優(yōu)勢(shì)，而且細(xì)胞毒性小、不良反應(yīng)小，能夠使晚期肺腺癌患者獲益，極大地延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，改善了預(yù)后[2]。因此，肺腺癌各驅(qū)動(dòng)基因的精準(zhǔn)檢測(cè)對(duì)于臨床治療的指導(dǎo)作用就顯得尤為重要。而肺腺癌的組織學(xué)分型不僅被認(rèn)為能夠更好地體現(xiàn)腫瘤的生物學(xué)行為，同時(shí)與腫瘤的發(fā)生、組織侵犯和預(yù)后評(píng)估存在直接聯(lián)系，部分國(guó)外學(xué)者認(rèn)為與分子學(xué)改變存在一定聯(lián)系[3]。本研究依據(jù)肺腺癌的國(guó)際多學(xué)科分類標(biāo)準(zhǔn)(IASLC/ATS/ERS)對(duì)收集肺腺癌病例進(jìn)行分類，同時(shí)利用二代測(cè)序(NGS)法檢測(cè)常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因的狀態(tài)，結(jié)合患者臨床特征，探討浸潤(rùn)性肺腺癌組織學(xué)亞型與驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

回顧性收集2017年9月—2020年8月九江市第一人民醫(yī)院確診為浸潤(rùn)性肺腺癌的手術(shù)標(biāo)本87 例，男53 例，女34 例；年齡32～85 歲，中位年齡61 歲，其中<60 歲38 例，≥60 歲49 例；有吸煙史31 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28 例；2018年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期Ⅰ～Ⅱ期57 例，Ⅲ～Ⅳ期30 例。

1.2 組織學(xué)形態(tài)

所有收集的肺腺癌組織學(xué)標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛隔夜固定后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片并蘇木精-伊紅(HE)染色。兩名高年資組織病理醫(yī)師采用雙盲法依據(jù)IASLC/ATS/ERS評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)組織學(xué)進(jìn)行分類，同時(shí)結(jié)合各組織學(xué)亞型在標(biāo)本中所占比例分為腺泡為主型、貼壁生長(zhǎng)為主型、微乳頭為主型、乳頭為主型和黏液實(shí)體為主型的亞型。

1.3 驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)

采用石蠟組織樣本基因抽提試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)對(duì)浸潤(rùn)性肺腺癌石蠟標(biāo)本按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣本濃度及吸光度(OD)值，確保濃度≥10 ng/μL，OD值為1.8～2.0。使用文庫(kù)制備試劑盒(美國(guó)Illumina公司)構(gòu)建DNA測(cè)序文庫(kù)，采用人多基因突變檢測(cè)試劑盒[表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(c-MET)、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物基因(BRAF)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS1)、RET原癌基因(RET)]和基因突變捕獲探針上高通量測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行測(cè)序，將所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾并生物信息學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法對(duì)各基因與臨床特征資料及組織學(xué)亞型的相關(guān)性進(jìn)行比較。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織形態(tài)學(xué)亞型

87 例浸潤(rùn)性腺癌經(jīng)HE染色后，腺泡為主型的亞型共45 例，占所有病例的51.7%，鏡下腫瘤呈腺管狀、篩孔狀排列，細(xì)胞立方柱狀向腔內(nèi)生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1A)；貼壁生長(zhǎng)為主型的亞型8 例(9.2%)，腫瘤異型稍小，細(xì)胞沿肺泡壁呈釘突狀生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1B)；乳頭為主型的亞型13 例(14.9%)，腫瘤呈2～3 級(jí)乳頭狀，以纖維血管為軸心；微乳頭為主型的亞型7 例(8.1%)，腫瘤呈簇狀、微乳頭狀，未見(jiàn)明顯的纖維血管軸心，伴腔內(nèi)脫落多量微乳頭狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1C)；黏液實(shí)體為主型14 例(16.1%)，腫瘤呈實(shí)性片狀生長(zhǎng)，伴部分細(xì)胞富含豐富的黏液成分(見(jiàn)圖1D)。最多的腺泡為主的亞型與較少的貼壁生長(zhǎng)和微乳頭狀為主型的亞型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.645，P<0.001)。

A：腺泡為主型(HE×100)；B：貼壁生長(zhǎng)為主型(HE×100)；C：微乳頭狀型(HE×100)；D：黏液實(shí)體型(HE×100)

2.2 臨床特征與驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)的關(guān)系

在87 例肺浸潤(rùn)腺癌8 種常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)中，檢出7 種驅(qū)動(dòng)基因共計(jì)68 例突變，其中單基因突變66 例，雙基因共存突變2 例(EGFR+c-MET和KRAS+BRAF)，總突變率為78.2%。EGFR共突變42 例(48.3%)(見(jiàn)圖2A)，其中女性突變率為64.7%，明顯高于男性的37.7%(P=0.014)；無(wú)吸煙史患者突變率為57.1%，明顯高于有吸煙史患者的32.3%(P=0.026)；臨床分期Ⅲ～Ⅳ患者突變率為63.3%，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者的40.4%(P=0.041)，但與年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系不大(P>0.05)(見(jiàn)表1)。KRAS共突變10 例 (11.5%)(見(jiàn)圖2B)，其中有吸煙史患者突變率為22.6%，明顯高于無(wú)吸煙史患者的5.4%(P=0.039)，但與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期關(guān)系不大(P>0.05)。ALK共突變8 例(9.2%)(見(jiàn)圖2C)，其中女性突變率為17.6%，明顯高于男性的3.8%(P=0.029)；<60 歲患者突變率為18.4%，明顯高于≥60 歲患者的2.1%(P=0.024)，但與吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期關(guān)系不大(P>0.05)。c-MET共突變5 例(5.7%)，其中女性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各突變4 例。BRAF突變 2 例(見(jiàn)圖2D)，EBER2和ROS1各突變1 例，但由于以上基因突變率低，暫未發(fā)現(xiàn)其與臨床特征的相關(guān)性。

表1 基因突變與臨床特征的關(guān)系

A：EGFR-L858R突變；B：KRAS-G12D突變；C：EML4-ALK融合；D：BRAF-V600突變

2.3 組織學(xué)亞型與驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)的關(guān)系

42 例EGFR突變病例中，腺泡為主型的亞型突變率為44.4%(20/45)，與其他類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.548，P=0.459)；而其中貼壁生長(zhǎng)為主型和微乳頭狀為主型突變率較高，分別為75.0%(6/8)和85.7%(6/7)，黏液實(shí)體為主型突變率明顯較低，僅為14.3%(2/14)；貼壁生長(zhǎng)及微乳頭狀為主型與其他類型EGFR突變具有相關(guān)性(χ2=7.305，P=0.007)。10 例KRAS突變病例中，腺泡為主型突變率為11.1%(5/45)，與其他類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.049，P=0.826)；其中突變率最高的是乳頭狀為主型的亞型15.4%(2/13)，最低的為黏液實(shí)體為主型的亞型7.1%(1/14)，各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。8 例ALK突變病例中，腺泡為主型的亞型突變率為4.4%(2/45)，與其他類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.479，P=0.224)；其中黏液實(shí)體為主型的亞型突變率最高，為28.6%(4/14)，與其他類型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.991，P=0.026)。5 例c-MET突變病例中，腺泡為主型的亞型突變率為6.7%(3/45)，與其他類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.006，P=0.937)；其中微乳頭為主型的亞型突變率最高，為28.6%(2/7)，與其他類型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率，P=0.042)。BRAF在腺泡為主型及黏液實(shí)體為主型各突變1 例，ERBB2和ROS1基因突變1 例均發(fā)生在腺泡為主型病例，由于納入研究病例較少，暫未發(fā)現(xiàn)其間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表2)。

表2 組織學(xué)亞型和基因突變的相關(guān)性 例(%)

3 討 論

肺腺癌的精準(zhǔn)靶向治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)取得的一項(xiàng)重大進(jìn)步，不僅豐富了常規(guī)的腫瘤治療手段，而且延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，改善了生存質(zhì)量[4]。精準(zhǔn)的治療需要精準(zhǔn)的基因檢測(cè)手段，二代測(cè)序技術(shù)作為一類新興的檢測(cè)技術(shù)，具有高通量、低成本、靈敏度高等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肺癌的多基因檢測(cè)中[5]。2020年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南推薦對(duì)所有能夠獲得的肺癌組織學(xué)標(biāo)本，應(yīng)常規(guī)檢測(cè)靶向基因EGFR，ALK，ROS1，BRAF，KRAS突變，針對(duì)新出現(xiàn)的靶向基因c-MET，RET，HRBB2也建議聯(lián)合檢測(cè)[6]。最近IASLC/ATS/ERS多學(xué)科分類對(duì)肺腺癌組織學(xué)分類做了重新修訂，廢除了“細(xì)支氣管肺泡癌”陳舊概念，同時(shí)引入了“原位腺癌”新的定義，在此基礎(chǔ)上引申是否具有微浸潤(rùn)性；同時(shí)不再使用混合亞型這一既往主要的浸潤(rùn)性腺癌分類，而單獨(dú)界定各自分型中的腺泡型、乳頭型以及黏液實(shí)體分泌型、貼壁生長(zhǎng)型及微乳頭型。在所有分型中貼壁生長(zhǎng)型預(yù)后最好，5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率達(dá)90%以上，而微乳頭亞型預(yù)后最差，5 年無(wú)復(fù)發(fā)生存率不足20%。因此，肺浸潤(rùn)性腺癌形態(tài)學(xué)變化的區(qū)分不僅能判定腫瘤的侵襲性，同時(shí)對(duì)預(yù)后評(píng)估極為重要[7]。近年來(lái)，有國(guó)外學(xué)者[8]在研究肺非小細(xì)胞癌的驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，各基因的突變狀態(tài)與組織學(xué)亞型間存在一定的聯(lián)系，能夠通過(guò)組織學(xué)亞型來(lái)預(yù)測(cè)基因突變的發(fā)生。

本研究對(duì)收集的浸潤(rùn)性肺腺癌87 例標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)亞型分類，腺泡為主亞型，占所有病例的51.7%，與較為少見(jiàn)的貼壁生長(zhǎng)為主型和微乳頭狀為主型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與關(guān)于形態(tài)學(xué)的研究類似[9]，證實(shí)腺泡為主型依然是最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型。利用NGS技術(shù)對(duì)87 例組織學(xué)標(biāo)本行常規(guī)的8 種靶向基因檢測(cè)，共檢出7 種驅(qū)動(dòng)基因共計(jì)68 例突變，總突變率78.2%。各突變基因在與臨床病理學(xué)相關(guān)性中，EGFR突變與女性、無(wú)吸煙史和臨床分期Ⅲ～Ⅳ期存在相關(guān)性，證實(shí)其在不吸煙的女性晚期肺腺癌患者中突變率更高，這與Song等[10]收集的肺腺癌大樣本研究EGFR與臨床病理間得出的結(jié)論一致，但與Wang等[11]研究認(rèn)為的EGFR突變與臨床分期并無(wú)明顯相關(guān)存在較大差異，這可能與各研究納入的標(biāo)本異質(zhì)性或含量差異有關(guān)。KRAS突變與吸煙史存在相關(guān)性，與Wang等[12]報(bào)道一致，表明其在吸煙患者中突變率較高。ALK融合基因與女性、<60 歲患者存在相關(guān)性，其基因?qū)W改變可能在年輕女性患者中突變率較高，Koh等[13]的研究也得出同樣的結(jié)論。c-MET突變率較低，國(guó)內(nèi)學(xué)者朱衛(wèi)東等[14]發(fā)現(xiàn)c-MET與女性患者存在相關(guān)性，本研究5 例中女性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各突變4 例，說(shuō)明有可能與上述兩個(gè)因素存在一定關(guān)系，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。ERBB2和ROS1各突變1 例，暫未發(fā)現(xiàn)其與臨床病理特征的相關(guān)性。EGFR突變中，微乳頭狀為主型突變率最高，為85.7%，黏液實(shí)體為主型突變率最低，僅14.3%，這些與Russell等[15]研究結(jié)果類似。相對(duì)于腺泡為主型、乳頭狀為主型和黏液實(shí)體為主型，EGFR突變與貼壁生長(zhǎng)為主型和微乳頭狀為主型具有明顯的相關(guān)性。Wang等[12]通過(guò)研究肺腺癌細(xì)胞學(xué)形態(tài)和分子學(xué)改變發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他類型，微乳頭類型的EGFR突變率更高，與本研究結(jié)果一致。KRAS突變?cè)诟餍螒B(tài)學(xué)亞型中均有分布，尚未發(fā)現(xiàn)之間的相關(guān)性，同時(shí)既往研究文獻(xiàn)也未見(jiàn)相關(guān)性報(bào)道[13]。ALK突變與黏液實(shí)體為主型具有相關(guān)性，雖然與Doebele等[16]認(rèn)為的ALK基因突變主要見(jiàn)于腺泡型和黏液實(shí)體為主型結(jié)果有一定出入，但與Jin等[17]的研究結(jié)果一致，認(rèn)為黏液實(shí)體為主型更易于發(fā)生ALK基因重排。雖然c-MET突變率較低，但有趣的是本研究發(fā)現(xiàn)其在微乳頭亞型中更占優(yōu)勢(shì)。由于該基因納入樣本及突變均數(shù)量較少，還存在一定的爭(zhēng)議，有望再擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)一步論證。BRAF，ERBB2，ROS1和RET突變率過(guò)低，尚未發(fā)現(xiàn)其與組織學(xué)亞型間的相關(guān)性。

綜上所述，浸潤(rùn)性肺腺癌EGFR突變更常見(jiàn)于女性、不吸煙和臨床分期Ⅲ～Ⅳ期為主型的患者，在貼壁生長(zhǎng)和微乳頭狀亞型中突變率更高。KRAS突變?cè)谖鼰熁颊咧卸嘁?jiàn)，但與組織學(xué)亞型關(guān)系不大。ALK突變與女性、年齡<60 歲患者及黏液實(shí)體為主型的亞型相關(guān)。而c-MET與女性患者及微乳頭狀組織學(xué)亞型關(guān)系密切。但對(duì)于BRAF，ERBB2，ROS1和RET基因突變與組織學(xué)亞型間的相關(guān)性尚不明確，因此，揭示更多驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)與組織學(xué)亞型間的相關(guān)性，將是我們今后的重點(diǎn)研究方向。