房延鳳 馬李杰 劉雁聲 南巖東 蘇 蔚 金發(fā)光 張 濤 張紅軍

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤[1-2]，亞洲人肺腺癌約占肺癌50%[3-4]，且很多肺癌診斷時(shí)已屬于晚期，目前其5年生存率仍很低，相關(guān)報(bào)道僅約13%[5]。以EGFR酪氨酸酶抑制劑為代表的分子靶向治療顯著延長(zhǎng)了晚期非小細(xì)胞肺癌患者生存期[6]，而EGFR基因突變檢測(cè)為非小細(xì)胞肺癌是否可以行靶向治療及靶向治療藥物選擇提供了重要依據(jù)[7]。大量研究表明，EGFR基因突變主要存在于18-21外顯子上[8]，TKI治療最有效的敏感突變?yōu)?9外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R點(diǎn)突變，既往研究報(bào)道，19外顯子的缺失突變約占EGFR突變的45%，L858R點(diǎn)突變占EGFR突變的40%～45%[9]。本文回顧性分析我科498例非小細(xì)胞肺癌患者通過ARMS法檢測(cè)其EGFR基因上19、21外顯子的2個(gè)突變位點(diǎn)，總結(jié)分析其突變臨床特征，為臨床治療提供參考。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選取2012年7月至2018年7月空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科確診的非小細(xì)胞肺癌498例，腺癌407例，鱗癌82例，腺鱗癌4例，大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌3例，肉瘤樣癌2例。其中男性305例，女性193例，最小年齡32歲，最大年齡82歲，中位年齡61.13歲。

二、設(shè)備與方法

1. 主要儀器和試劑: Roche 480Ⅱ熒光定量PCR儀，Invitrogen Qubit 2.0核酸蛋白定量?jī)x，Thermo PICO17臺(tái)式高速離心機(jī)，水浴鍋等；DNesasy? Blood & Tissue Kit(QIAGEN)，QIAamp? DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)，QIAamp? Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)，EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(蘇州為真)等。

2. 核酸純化： ①胸水和新鮮組織：所取樣本必須明確病理及腫瘤細(xì)胞含量。胸水50 ml低速離心5 min棄上清，沉底物-20 ℃保存或進(jìn)入下一步純化；新鮮組織需芝麻粒大小1～2塊。處理好樣本之后，按照DNesasy? Blood & Tissue Kit(QIAGEN)流程純化核酸；②外周血：采集患者化療前或化療后4周外周血8～10 ml(EDTA抗凝)，按照QIAamp? Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)流程純化ctDNA；③石蠟組織：取石蠟組織切片3～5 μm厚，5～10片，按照QIAamp? DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)流程純化核酸。

為保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，純化獲得的DNA，在檢測(cè)前需進(jìn)行含量測(cè)定。要求：DNA純度檢測(cè)OD260/280比值在1.8～2.0，DNA濃度不低于10 ng/μl。純化好的DNA -20 ℃保存或進(jìn)入下一步EGFR基因突變檢測(cè)。

3. EGFR基因突變檢測(cè)： 檢測(cè)使用蘇州為真公司EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)。試劑盒基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺(tái)，利用突變特異擴(kuò)增PRCR和溶解曲線分析結(jié)合技術(shù)檢測(cè)基因特定突變。該技術(shù)以偏向擴(kuò)增技術(shù)(amplification refractory mutation system, ARMS)為主，融合了溶解曲線(Melting Curve)和野生型DNA阻滯序列野生型阻滯探針兩種技術(shù)，熒光PCR檢測(cè)體系中所使用指示劑為Evagreen熒光染料。將DNA調(diào)整濃度至5 ng/ml，按照EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)說明進(jìn)行試劑混合和上機(jī)操作。

4. 結(jié)果判讀： ①陽性質(zhì)控(STD)有擴(kuò)增曲線且Ct值<40，且峰形正常；②Ct值要求：每個(gè)位點(diǎn)的ΔCt值臨界值及樣本內(nèi)控要求見試劑盒使用說明；③陽性樣本：有典型S型擴(kuò)增曲線，且某個(gè)位點(diǎn)的ΔCt值在切值范圍內(nèi)，同時(shí)該位點(diǎn)的溶解峰形的Tm值與STD該位點(diǎn)溶解峰形的Tm值的差值絕對(duì)值小于或等于1。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件包處理，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(n)和構(gòu)成比(%)表示，組間比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、入選患者E19-Del、L858R總體突變情況

498例非小細(xì)胞肺癌中E19-Del、L858R共突變108例，突變率21.687%，其中男性共突變49例，突變率為16.066%；女性共突變59例，突變率30.570%。

二、E19-Del突變情況與臨床特征

498例非小細(xì)胞肺癌中E19-Del突變63例(12.651%)，其中小于50歲突變率21.127%，大于等于50歲而小于70歲突變率10.458%，大于等于70歲突變率13.223%，三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腺癌E19-Del突變率15.233%，其他類型突變率1.099%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ⅳ期患者E19-Del突變率14.653%，Ⅲ期患者E19-Del突變率6.329%，Ⅰ期和Ⅱ期患者E19-Del突變率3.333%，三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Ⅳ期和Ⅲ期突變率比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。E19-Del突變特征還表現(xiàn)在：均是未并發(fā)其它腫瘤，女性突變率高于男性，合并骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移的突變率高于無轉(zhuǎn)移的，胸膜、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組突變率高于有轉(zhuǎn)移組，無糖尿病、高血壓組突變率高于合并糖尿病、高血壓，左肺腫瘤突變率略高于右肺腫瘤，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

三、E19-Del突變與吸煙量相關(guān)性比較

不吸煙組E19-Del突變率14.286%，吸煙每天大于20支突變率5.333%，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；吸煙每天小于或等于20支突變率13.415%，與不吸煙、吸煙每天大于20支三組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不吸煙組與吸煙每天小于或等于20支突變率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；吸煙每天小于或等于20支者與吸煙每天大于20支者突變率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

表2 E19-Del突變與吸煙量分層特征

表1 E19-Del突變率與臨床分層特征

四、L858R突變情況與臨床特征

498例非小細(xì)胞肺癌中L858R突變45例，突變率9.036%，其女性突變率15.026%，男性突變率5.246%，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不吸煙組L858R突變率12.355%，吸煙每天小于或等于20支突變率5.488%，吸煙每天大于20支突變率5.333%，三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腺癌L858R突變率10.565%，其它類型其突變率2.198%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移組L858R突變率7.051%，發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移突變率12.366%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L858R突變特征還表現(xiàn)在：年齡分層越大突變率越高，大于等于70歲其突變率最高，分期中突變率由高到低依次是Ⅱ期、Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期，并發(fā)其它腫瘤組突變率高于未并發(fā)其它腫瘤，合并骨轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的突變率高于無轉(zhuǎn)移組，頭顱未轉(zhuǎn)移的突變率高于有轉(zhuǎn)移組，無糖尿病、高血壓者突變率高于合并糖尿病、高血壓組，右肺腫瘤突變率高于左肺腫瘤，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

討 論

據(jù)報(bào)道在北美和西歐約10%的病例存在EGFR突變，但其中30%～50%病例屬于東亞血統(tǒng)[10]。不同種族中EGFR表達(dá)率不一樣[11]，既往研究證實(shí)，在亞裔、非吸煙、女性腺癌患者更常見[12]，即 E19-Del和L858R更常見不吸煙者，本文中E19-Del、L858R突變率均是非吸煙組高于吸煙組，吸煙量越大突變率越低，E19-Del突變率在不吸煙組與吸煙每天大于20支組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，L858R突變率在不吸煙組、吸煙每天小于等于20支組、吸煙每天大于20支組三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。EGFR突變?cè)诜西[狀細(xì)胞癌中極少，鱗癌中偶然檢測(cè)到被一些人認(rèn)定為對(duì)腺鱗癌或低分化的病例誤診[13]。本文中E19-Del、L858R突變率腺癌高于其它類型腫瘤，L858R在并發(fā)胸膜轉(zhuǎn)移組突變率高于無胸膜轉(zhuǎn)移組，可能與胸膜轉(zhuǎn)移主要發(fā)生于腺癌患者，以上均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)論與既往研究相符，表明EGFR-TKI治療更適宜這種特征的患者。其次，E19-Del、L858R突變率雖均是女性高于男性，L858R突變率性別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但E19-Del突變率性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析可能與入選病例男女性別數(shù)有關(guān)，后續(xù)進(jìn)一步用大樣本驗(yàn)證。

表3 L858R突變率與臨床分層特征

國(guó)外有研究表明，腫瘤分期也會(huì)影響突變率。Sloan Kettering組得出在多個(gè)治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的大型隊(duì)列中，EGFR突變率為27%[14]，本文結(jié)果中E19-Del分期突變率由高到低依次是Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期、Ⅱ期，且Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期及Ⅲ期、Ⅳ期的相互比較為分期越晚突變率越高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L858R分期突變率由高到低依次是Ⅱ期、Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這點(diǎn)和既往研究結(jié)論以及E19-Del分期突變率不同，考慮一方面入選病例大部分是臨床分期，部分和術(shù)后分期存在一定差異。

本文結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，并發(fā)骨轉(zhuǎn)移組E19-Del、L858R突變率高于無骨轉(zhuǎn)移組；腦轉(zhuǎn)移組E19-Del突變率高于無轉(zhuǎn)移組，L858R相反；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組L858R突變率高于無轉(zhuǎn)移組，E19-Del相反。E19-Del、L858R突變率在未并發(fā)糖尿病、高血壓的NSCLC組高于合并糖尿病、高血壓組。未并發(fā)其它腫瘤組E19-Del突變率高于并發(fā)其它腫瘤組，L858R相反。發(fā)生于左肺的非小細(xì)胞肺癌E19-Del突變率高于右肺，L858R相反。由此可見，E19-Del、L858R突變率與未合并糖尿病、高血壓、并發(fā)骨轉(zhuǎn)移正相關(guān)，E19-Del、L858R在腫瘤發(fā)生部位、并發(fā)其它腫瘤和是否并發(fā)腦、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)突變率與臨床特征相反。其次，E19-Del突變率在年齡小于50歲組最高，且小于50歲、大于等于50歲而小于70歲、大于等于70歲三組突變率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；L858R年齡分層越大突變率越高，綜上，E19-Del突變易發(fā)生于年輕患者，L858R突變易發(fā)生于年老患者。

研究顯示，外顯子E19-Del和L858R基本都是早期參與腫瘤克隆事件，而且當(dāng)這些突變被靶向時(shí)，通常在多個(gè)癌癥部位觀察到反應(yīng)[15]。但在攜帶E19-Del突變的NSCLC病例中療效優(yōu)于L858R突變的患者[16]，因此E19-Del、L858R突變的臨床特征和療效之間存在相關(guān)性。此外，既往研究證明如果患者只有E19-Del或L858R突變，可從第一代EGFR-TKI藥物中獲益[17]。一旦患者有雙重突變E19-Del和T790M或E19-Del和L858R，他們將不會(huì)受益于第一代EGFR-TKI藥物，可能會(huì)受益于第三代EGFR-TKI藥物[18]。

總之，NSCLC患者EGFR常見突變基因突變臨床特征差異與民族、遺傳學(xué)背景、環(huán)境因素、檢測(cè)方法等多種因素相關(guān)，本文結(jié)果通過498例以陜西省及周邊地區(qū)為著的NSCLC患者E19-Del、L858R突變臨床特征研究，分析突變臨床特點(diǎn)，有助于進(jìn)一步思考、探索、優(yōu)化本地區(qū)NSCLC個(gè)體化治療。