張 潔，李 方，齊長海，梁國威*

(1.北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗科,北京100049；2.航天中心醫(yī)院 病理科)

2013 年科學(xué)雜志首次報道了在黑色素瘤家系和患者中檢測到端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動子區(qū)域-124 bp(C/T，C228T)和-146 bp (C>T，C250T )高突變率(突變率>70%)[1]，該熱點突變在肝細(xì)胞肝癌(HCC)組織中的突變率高達(dá)60%[2]，已成為肝癌及多種惡性腫瘤的診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估的重要分子監(jiān)測靶點[3,4]。

目前，檢測TERT該熱點突變的方法只有二代測序和液滴數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)平臺(突變檢測下限分別為0.1%左右和0.1%-0.05%左右)2種方法[5,6]，但皆存在不適用于臨床常規(guī)開展等問題。我們以普通PCR擴(kuò)增含有TERT熱點突變位點的純化產(chǎn)物作為檢測標(biāo)本，采用等位基因擴(kuò)增阻滯原理(ARMS)的引物，并結(jié)合鎖核酸(LNA)抑制探針，建立了實時熒光定量PCR檢測TERT啟動子熱點突變率方法(ARMS-LNA-qPCR)，并在30例表觀健康人中確定檢測下限。

1 對象與方法

1.1 研究對象

表觀健康者：收集我院2019年3月-2019年5月健康體檢確認(rèn)的表觀健康志愿者30例，納入標(biāo)準(zhǔn)為：無乙肝、丙肝、藥物肝、酒精肝病史或肝臟蜘蛛痣，實驗室檢查肝、腎功能正常，根據(jù)腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)檢查除外惡性腫瘤。其中男性16例，女性14例，年齡范圍21-35歲，平均年齡29.1±3.8歲。本研究通過航天中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查(項目批號：20190830-YN-01)。

1.2 表觀健康人外周血基因組DNA

EDTA抗凝外周全血200 μl用于基因組DNA提取，采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取試劑盒(目錄號：DP304-02)，按試劑盒說明操作。提取后的組織DNA立即-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ARMS-LNA-qPCR方法建立

采用2步法建立TERT啟動子區(qū)-124bp(C/T)和-146bp(C/T)突變率檢測方法。第一步富集模板，普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后作為待檢標(biāo)本；第二步突變率檢測，以ARMS-LNA-qPCR中ΔCt值(ΔCt值=內(nèi)參Ct值-突變率標(biāo)準(zhǔn)品Ct值)與突變率標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得。所建方法的檢測原理、引物、探針及循環(huán)條件見國家知識產(chǎn)權(quán)局專利申請?zhí)?01910991396.3。

1.4 直接測序

為了驗證ARMS-LNA-qPCR方法的準(zhǔn)確性，30例表觀健康人全部采用直接測序法進(jìn)行了測序(諾賽基因技術(shù)有限公司，北京，中國)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ARMS-LNA-qPCR定量檢測TERT突變率標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用所建ARMS-LNA-qPCR方法，分別檢測突變率標(biāo)準(zhǔn)品為100%、10%、1%、0.1%、0.05%和0%(100%W)的-124bp(C/T)和-146bp(C/T)突變率，其突變率擴(kuò)增曲線及△Ct與Lg突變率回歸曲線見圖1。

對于-124位點，ARMS-LNA-qPCR突變率擴(kuò)增曲線圖(重復(fù)2次)顯示檢測突變率的下限達(dá)到0.05%(Y=-3.801X+33.02，R2=0.999，P<0.001)，其ΔCt(0.05%M-100%W)=-2.11，這一差值區(qū)間可以顯著區(qū)分0.05%突變和100%野生樣本。為了監(jiān)控富集PCR產(chǎn)物質(zhì)量并校準(zhǔn)紫外分光光度計測定濃度所引起誤差，我們采用1011拷貝數(shù)/ml突變率標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定5次，建立了△Ct 值(內(nèi)參qPCR的Ct值減去ARMS-LNA-qPCR的Ct值)與-124位點突變率的內(nèi)參突變率標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示Lg-124突變率與△Ct 值呈線性關(guān)系(P<0.001，R2=0.999)，其突變率回歸方程為-124突變率= 10(0.262×△Ct+4.325)，見圖1(A-1和A-2)。

對于-146位點，ARMS-LNA-qPCR突變率擴(kuò)增曲線圖(重復(fù)2次)顯示檢測突變率的下限達(dá)到0.05%(Y=-3.834X+32.097，R2=0.999，P<0.001)，其ΔCt(0.05%M-100%W)=-1.92，這一差值區(qū)間可以顯著區(qū)分0.05%突變和100%野生樣本。采用1011拷貝數(shù)/ml突變率標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定5次，結(jié)果顯示Lg-146突變率與△Ct 值呈線性關(guān)系(P<0.001，R2=0.999),其突變率回歸方程為-146突變率= 10(0.261△Ct+3.895)，見圖1(B-1和B-2)。

2.2 ARMS-LNA-qPCR方法檢測下限的判定

3 討論

本研究在ARMS-qPCR的基礎(chǔ)上，采用LNA抑制探針選擇性抑制ARMS-qPCR中突變引物對野生等位基因的非特異性擴(kuò)增，成功建立了高敏感定量檢測TERT啟動子-124bp和-146bp位點突變率的ARMS-LNA-qPCR方法。該方法定量檢測-124bp和-146bp位點突變率的下限是0.07%和0.05%。

ARMS-LNA-qPCR方法成立的關(guān)鍵是LNA抑制探針對野生和突變等位基因的結(jié)合具有極強(qiáng)的選擇性。研究顯示，寡核苷酸中1個堿基進(jìn)行LNA修飾可增加其Tm值3-8℃，如果錯配發(fā)生在LNA堿基上，其與DNA親和力則明顯下降，利用這一特性可明顯增加LNA修飾探針對等位基因的區(qū)分能力[7]。我們在ARMS-qPCR中逐漸增加LNA抑制探針的濃度，通過比較100%和0%TERT-124和-146突變標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的變化，最終選擇0.25 μM(-124位點)和0.2 μM(-146位點)終濃度的LNA抑制探針作為抑制野生等位基因擴(kuò)增的合適水平。需要注意的是，由于各實驗室條件不盡相同，建議不同實驗室注意LNA抑制探針濃度的優(yōu)化。

圖1 ARMS-LNA-qPCR方法測定TERT-124bp(C/T) 和-146bp(C/T)位點突變率標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線及Lg突變率-△Ct值回歸曲線圖

A-1：1011拷貝數(shù)/ml突變率標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖，ΔCt(0.05%M-100%W)=-2.11 ;A-2：Lg-124突變率與ΔCt值(124內(nèi)參qPCR的Ct值減去-124 ARMS-LNA-qPCR的Ct值)的突變率回歸曲線；B-1：1011拷貝數(shù)/ml突變率標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖，ΔCt(0.05%M-100%W)=-1.92; B-2：Lg-146突變率與ΔCt值(124內(nèi)參qPCR的Ct值減去-146 ARMS-LNA-qPCR的Ct值)的突變率回歸曲線。

我們建立的ARMS-LNA-qPCR方法，采用PCR純化產(chǎn)物在qPCR技術(shù)平臺上進(jìn)行檢測，其TERT-124bp和-146bp位點突變率的檢測下限為0.07%和0.05%，與二代測序和ddPCR檢測下限基本相同。由于qPCR技術(shù)平臺是目前臨床常規(guī)分子檢測技術(shù)平臺，且所建方法采用PCR擴(kuò)增純化標(biāo)本進(jìn)行檢測，因此ARMS-LNA-qPCR方法具有臨床廣泛開展的適用性和多種標(biāo)本來源的普適性。

綜上所述，本研究建立的ARMS-LNA-qPCR方法靈敏度較高，其敏感性和重復(fù)性皆可滿足臨床需要。由于采用qPCR技術(shù)平臺和PCR擴(kuò)增純化標(biāo)本進(jìn)行檢測，該方法具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。