丁玉紅，郭秀穎

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 皮膚科，吉林 長春130031)

冠心病治療過程中，在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血液灌注后，心肌組織的損傷不僅沒有緩解反而變得更加嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)不可逆性損傷，即心肌缺血再灌注損傷(I/R)[1]。有研究表明I/R可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，而ERS又在I/R的病理進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，持久劇烈的ERS則會誘發(fā)細(xì)胞凋亡[2,3]。丹參作為一種傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，常用于冠心病的治療[4,5]。丹參素(DLA)作為丹參中主要的活性成分，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景[6,7]。但丹參素能否通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善心肌I/R損傷目前尚未報道。本研究擬在離體培養(yǎng)的H9C2人心肌細(xì)胞上，觀察丹參素對缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的改善作用，從抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抗凋亡等方面探討丹參素對H/R 損傷的保護機制，旨在為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器丹參素購自中國云南昆明風(fēng)山漸醫(yī)藥研究有限公司。H9C2人心肌細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。高糖DMEM 培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司；胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗及DMSO 購自美國Sigma 公司；LDH、CK-MB、MDA和SOD活性的ELISA試劑盒購自Andygene公司?？贵wGRP78和Caspase-12購自Abcam公司；抗體 Bax、Bcl-2、cleaved caspase3、SOD、GAPDH和抗兔的二抗購自CST公司。BCA 蛋白定量試劑盒購自北京普利萊公司。余為市售分析純產(chǎn)品。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司； 超凈工作臺購自上海智成分析儀器制造有限公司；高速低溫離心機(湖南湘儀公司)；DYY電泳儀(北京六一儀器廠)；DYCZ-轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)；X線膠片(樂凱公司)；電子分析天平(德國賽多利斯公司)；脫色搖床(北京六一儀器廠)；PVDF轉(zhuǎn)移膜(GE Healthcare公司，0.42 μm)；超純水儀購自美國Merck Millipore公司。

1.2 H9C2人心肌細(xì)胞H/R 模型構(gòu)建和分組

H9C2人心肌細(xì)胞(含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)到對數(shù)生長期。缺氧處理前將高糖DMEM培養(yǎng)基換為無糖DMEM培養(yǎng)基，放入?yún)捬跸?7℃恒溫培養(yǎng)。缺氧結(jié)束后，新鮮的高糖DMEM培養(yǎng)基替換無糖DMEM培養(yǎng)基，放入正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為正常對照組，H/R組和丹參素給藥組。正常對照組:用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞30 h。H/R組:缺氧處理前將高糖DMEM培養(yǎng)基換為無糖DMEM培養(yǎng)基，放入?yún)捬跸?7 ℃恒溫培養(yǎng)6 h。缺氧結(jié)束后，高糖DMEM培養(yǎng)基替換無糖DMEM培養(yǎng)基，放入正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。DLA給藥組:缺氧處理前將高糖DMEM培養(yǎng)基換為無糖DMEM培養(yǎng)基，加入DLA(10-6M)缺氧培養(yǎng)6 h。缺氧結(jié)束后，高糖DMEM 培養(yǎng)基替換無糖DMEM培養(yǎng)基，放入正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 ELISA法檢測H9C2人心肌細(xì)胞中LDH、CK-MB、MDA含量和SOD活性

實驗結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，加入PBS洗3次，再加入200 μl含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，4 ℃ 13 500 rpm離心15 min，吸取上清于EP管中，放入-80 ℃凍存。按照ELISA試劑盒的說明檢測LDH、CK-MB、MDA含量和SOD活性。以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上設(shè)置450 nm波長測量各孔吸光度并計算最終濃度。

1.4 Western blot 法檢測蛋白表達實驗結(jié)束收集H9C2人心肌細(xì)胞,PBS洗3遍，加入200 μl含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，超聲破碎細(xì)胞，4℃，13 500 rpm離心25 min，吸取上清于EP管中，放入-80℃凍存。取10 μl蛋白樣品進行蛋白定量。取蛋白樣品20 μg上樣，10 % SDS-PAGE 電泳。用含5 %脫脂奶粉的封閉液封閉1 h 后，分別加入一抗GRP78(1∶1000)、Caspase-12(1∶1000)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000) 、SOD(1∶1000)和GADPH(1∶2000)，4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 各組LDH和CK-MB的水平

與正常對照組相比,H/R處理培養(yǎng)的H9C2人心肌細(xì)胞中LDH和CK-MB水平明顯增加(P<0.05)；與H/R組相比，DLA可明顯減少細(xì)胞中LDH和CK-MB的水平(P<0.05)。見表1。

表1 DLA對H/R 誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中LDH和CK-MB的影響

*P<0.05 vs.正常對照組；#P<0.05 vs.缺氧/復(fù)氧組。

2.2 各組MDA含量和SOD活性

與正常對照組相比,H/R處理培養(yǎng)的H9C2人心肌細(xì)胞中MDA含量明顯增加，SOD活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1；與H/R組相比，DLA可明顯減少細(xì)胞中MDA的含量，增加SOD活性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.3 免疫印跡法檢測各組GRP78、Caspase-12和SOD蛋白水平

Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，H/R組GRP78和Caspase-12蛋白表達水平明顯增高，同時SOD蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DLA抑制H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)GRP78、Caspase-12和SOD蛋白水平變化，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

圖1 DLA對H/R 誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中MDA和SOD活性的影響

圖2 DLA對H/R 誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中GRP78、Caspase-12和SOD蛋白水平的影響

2.4 免疫印跡法檢測各組凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2水平

Western blot結(jié)果顯示:與正常組相比，H/R 誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中Bax蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；DLA可抑制H/R 誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中Bax蛋白表達水平的增高和Bcl-2蛋白表達水平的降低(P<0.05)，結(jié)果見圖3。

圖3 DLA對H/R 誘導(dǎo)的H9C2人心肌細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

3 討論

通過溶栓或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療可以及早恢復(fù)心肌灌注，是減少心肌梗死面積、改善臨床預(yù)后最有效的方法。然而缺血心肌血流恢復(fù)可能引起心肌缺血再灌注損傷[8]。誘發(fā)I/R的原因較為復(fù)雜，涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和鈣超載等原因[9,10]。有研究表明，I/R能造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[11]。對離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧可以在體外模擬心肌I/R。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：H/R可以誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的H9C2人心肌細(xì)胞發(fā)生損傷，而丹參素可以改善H/R對H9C2細(xì)胞的損傷作用，其作用與其抑制H9C2細(xì)胞發(fā)生凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

LDH和CK-MB是兩種重要的心肌酶，其水平高低可反映細(xì)胞的受損程度[12,13]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)H/R可以誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中LDH和CK-MB含量明顯增加，而丹參素可以顯著降低細(xì)胞中LDH和CK-MB的含量，提示丹參素可以減輕H/R誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞損傷。

作為氧自由基攻擊生物膜的終產(chǎn)物，MDA含量高低可反映機體細(xì)胞受自由基損傷程度；抗氧化酶SOD活性高低可反映機體清除氧自由基的能力[14,15]。本實驗結(jié)果顯示，H/R可以誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中MDA 含量顯著增高，SOD 活性明顯降低，表明H/R時細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，對氧自由基的清除能力降低；而丹參素可明顯降低MDA 含量，增強SOD 活性，說明丹參素可通過增強機體對氧自由基的清除能力，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷而發(fā)揮心肌細(xì)胞保護作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中的重要細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運等。但在感染、炎癥等不良刺激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，功能發(fā)生紊亂，大量錯誤折疊、未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累觸發(fā)ERS[16,17]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，表達上調(diào)可以作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志[18]。ERS造成組織細(xì)胞損傷也主要包括Caspase-12凋亡通路的激活[19]。本實驗結(jié)果表明：H/R可以誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中GRP78和Caspase-12含量明顯增加，而丹參素可以顯著降低細(xì)胞中GRP78和Caspase-12的含量，提示丹參素可以減輕H/R誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的重要指標(biāo)，包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。其中Bcl-2和Bax分別屬于抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。本研究結(jié)果顯示：H/R可以誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中Bcl-2蛋白含量明顯降低，Bax蛋白含量明顯增加；而丹參素可以顯著降低細(xì)胞中Bcl-2蛋白含量的降低和Bax蛋白含量的增加，提示丹參素可以減輕H/R誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞發(fā)生的凋亡。

綜上所述，丹參素對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有一定的保護作用，該作用可能通過抑制Bcl-2蛋白含量的降低、Bax蛋白含量的增加、降低細(xì)胞中GRP78和Caspase-12的含量等機制，從而抑制心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，為其臨床應(yīng)用改善心肌缺血再灌注損傷提供了理論基礎(chǔ)。