李萬順 張德宇 劉月 吳暢 彭立嗣 李詩鈺 楊錚暉 尹華 金震東 黃浩杰

海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,上海 200433

【提要】 本文介紹一種迅速、簡便、產(chǎn)量大、操作難度小的小鼠胰腺腺泡細胞的分離方法,供胰腺基礎(chǔ)研究者參考。

由于胰腺腺泡細胞解離時容易產(chǎn)生和分泌各種消化酶對自身進行消化[1],因此體外原代培養(yǎng)胰腺腺泡細胞非常困難。1972年,Amesterdam和Jamieson[2]發(fā)明了一種胰腺腺泡細胞分離并體外培養(yǎng)的方法,但該法操作復雜,且花費時間長。本課題組前期曾設(shè)計了一種有效的胰腺腺泡細胞原代培養(yǎng)方法[3],但產(chǎn)量較低,不利于后續(xù)實驗的進行。本研究在此基礎(chǔ)上通過改進,建立了一種在體外能快速簡便地分離、培養(yǎng)胰腺腺泡細胞的方法,旨在為胰腺基礎(chǔ)研究工作者提供參考。

一、材料與方法

1．實驗材料:健康成年野生型C57BL/6黑鼠,體重23～28 g,雌雄不限,由海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,第一附屬醫(yī)院消化病研究所專人飼養(yǎng),規(guī)律進食和飲水。解離液由Hanks平衡鹽溶液(HBSS)加2.38 g/ml HEPES、200 U/ml膠原酶Ⅳ和0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑混勻配成。緩沖液由HBSS加10%胎牛血清、0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑和2.38 g/ml HEPES混勻配成。培養(yǎng)液由DMEM培養(yǎng)基加0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合物混勻配成。phadebas溶液用14 ml淀粉酶溶液溶解1粒phadebas amylase substrate藥片配制,攪拌后使用。

2．方法:頸椎脫臼法處死小鼠,浸泡在醫(yī)用酒精2 min后固定于超凈工作臺上。腹部消毒后從小鼠生殖器上部至橫膈膜間剪開一個V形切口并翻開,將肝葉向上推以充分暴露胰腺和脾臟。用鑷子夾住脾臟和胰腺連接處,拉出胰腺,再用無菌手術(shù)剪刀沿腸道邊緣完整剪下胰腺。將胰腺放入裝有50 ml HBSS的無菌聚丙烯管,去除漂浮的脂肪組織,夾出沉在管底的胰腺組織置于無菌培養(yǎng)皿中,用剪刀和手術(shù)刀將胰腺均勻切成1～3 mm的小塊,然后移至50 ml無菌聚丙烯管內(nèi),4℃下20 g/min離心1 min,棄上層細胞碎片和血細胞,沉淀的胰腺碎塊加入8 ml解離液移至細胞瓶內(nèi),置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min,每隔5 min用3 mm無菌巴氏管來回吹打胰腺碎片10次,并同時仔細觀察胰腺狀態(tài)。當胰腺組織被完全解離時,加入10 ml預冷的緩沖液終止反應,以防胰腺腺泡細胞被過度消化。再將其移入50 ml無菌聚丙烯管內(nèi),4℃下20 g/min離心1 min,小心吸棄上清后立即加入10 ml預冷的緩沖液重懸,再在4℃下以20 g離心1 min,吸棄上清,重復操作3次。將細胞顆粒重新懸浮于8 ml配好的培養(yǎng)液,并轉(zhuǎn)入裝有100 μm過濾器的50 ml離心管,靜置過濾2 min,吸棄上清,沉淀即為原代胰腺腺泡細胞。將新鮮提取出來的原代腺泡細胞接種于6孔板分別培養(yǎng)1、2、4 d,置鏡下觀察腺泡細胞形態(tài),以未培養(yǎng)的新鮮提取的原代腺泡細胞為對照,判斷腺泡細胞的激活程度。

二、結(jié)果

1．原代培養(yǎng)腺泡細胞的形態(tài)變化:光鏡下可見新鮮提取的腺泡細胞光滑且呈圓形,多懸浮在培養(yǎng)基的表面,3～7個集聚呈團狀,周圍無泡狀物。細胞質(zhì)較為清楚,內(nèi)有大量酶原小顆粒廣泛分布(圖1A)。細胞碎片和雜質(zhì)較少。培養(yǎng)1 d后,絕大部分細胞團周圍有形態(tài)不規(guī)則的泡狀物產(chǎn)生,此種泡狀物為原代腺泡細胞激活后而分泌的含有活化的胰酶囊泡,且細胞周圍分布有大量由原代腺泡細胞分泌的酶原小顆粒(圖1B)。培養(yǎng)2 d后,泡狀物增大并逐漸趨于圓形,細胞周圍的囊泡也明顯增多(圖1C)。表明隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞的活化增強。但培養(yǎng)4 d后,部分原代腺泡細胞的細胞膜開始變得不完整,周邊的囊泡也逐漸減少,表明細胞的分泌能力開始消失,細胞逐漸死亡(圖1D)。提示本法提取出來的腺泡細胞能夠在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)存活3～4 d,但培養(yǎng)2 d后,細胞的分泌能力和極性會隨著時間的推移慢慢消失,最終腺泡細胞會轉(zhuǎn)化為單層上皮樣細胞并逐漸死亡。

圖1 新鮮提取的原代胰腺腺泡細胞(1A)及培養(yǎng)1(1B)、2(2C)、4(1D)d后的腺泡細胞形態(tài)變化(×40)

2．CCK-8刺激后腺泡細胞淀粉酶分泌水平的變化:以未加CCK-8刺激的腺泡細胞分泌的淀粉酶水平為0。CCK-8刺激后,腺泡細胞分泌的淀粉酶水平隨CCK-8濃度的增加而升高。當CCK-8濃度為2.0 mmol/ml時,腺泡細胞分泌的淀粉酶水平達到峰值,約為未加CCK-8刺激組的80倍。隨后腺泡細胞分泌淀粉酶水平下降(圖2)。提示用此種解離方法解離的胰腺腺泡細胞自激活和受損情況非常輕微。

圖2 不同濃度CCK-8體外刺激胰腺腺泡細胞30 min后的淀粉酶分泌曲線圖

討論腺泡細胞構(gòu)成絕大部分的胰腺實質(zhì),其主要功能是產(chǎn)生和釋放各種消化酶。目前認為,胰腺炎的發(fā)生與腺泡細胞受損密切相關(guān)[1-2,4]。以往已有研究證明,急性胰腺炎的發(fā)病機制可能是腺泡細胞自身過度激活,導致其體內(nèi)的各種酶也被激活,然后對自身腺體進行消化[5],因而分離獲取可靠和穩(wěn)定的胰腺腺泡細胞,可以為胰腺炎的基礎(chǔ)研究提供重要的工具。但是,無論是對胰腺腺泡細胞進行分離,還是對其進行體外培養(yǎng),都較為困難。

在體外,腺泡細胞容易發(fā)生自激活,對自身造成損害,并且蛋白酶、鈣離子等螯合劑也會破壞正常胰腺腺泡細胞。Dorrell等[6]用熒光激活細胞分選法(fluorescent activated cell sorting, FACS)對小鼠胰腺腺泡細胞、導管和內(nèi)分泌細胞成功進行分離,但FACS不僅操作繁瑣,且技術(shù)水平要求高,分選出來的腺泡細胞大多缺失部分初始結(jié)構(gòu)。Gout等[7]使用含有HEPES、膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶抑制劑的Hanks消化液對胰腺腺泡細胞進行分離,并且在培養(yǎng)液中加入表皮生長因子,在體外可培養(yǎng)7 d,但該法有3個明顯缺陷:(1)分離的腺泡細胞會在體外逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閷Ч軜蛹毎?導致24 h后無法對CCK-8做出有效的胰酶分泌反應。(2)Ⅰ型膠原酶容易導致腺泡細胞自激活,表現(xiàn)為在沒有刺激情況下就能夠觀察到原代腺泡細胞周圍有許多酶原顆粒小泡。(3)在進行功能學實驗之前,需要將胰腺腺泡細胞培養(yǎng)1 d,換液之后才能夠進行,前期準備工作復雜。上述方法較之傳統(tǒng)分離方法而言,都有一定的進步,能夠獲得較為理想的胰腺腺泡細胞,但缺點在于損傷了胰腺腺泡細胞的部分功能,并且胰腺組織的消化也不夠充分。鑒于此,本課題組前期曾提出一種腺泡提取并原代培養(yǎng)的方法,即采用膠原酶、胰蛋白酶抑制劑溶于DMEM細胞培養(yǎng)液消化小鼠胰腺,經(jīng)過消化、水浴、重懸、過濾、沉淀等一系列操作,在2 h內(nèi)分離出小鼠原代胰腺腺泡細胞[3]。但在實踐中筆者發(fā)現(xiàn),此法雖極大地減輕了胰腺腺泡細胞的自激活,但有兩個局限性:(1)產(chǎn)量較低,一只成年C57小鼠僅僅能提取1×106個左右的腺泡細胞。(2)無法全部在細胞間和超凈臺內(nèi)進行,易導致細胞污染。本研究采用的改進方法是用膠原酶Ⅳ和HEPES配置的HBSS混合溶液在細胞瓶內(nèi)對胰腺進行消化,并聯(lián)合吸管機械吹打進行解離,解離前后盡量減少離心時間和離心力,最后通過自然沉淀去除雜質(zhì)。本法能夠減少細胞碎片和雜質(zhì),降低胰腺腺泡細胞自激活,故獲得的胰腺腺泡細胞可直接用來進行CCK-8或雨蛙素激活試驗。該方法能夠快速從小鼠胰腺成功分離得到較大量(1×107個)的較純的原代未激活的胰腺腺泡細胞,且過程較其他方法更為簡便經(jīng)濟。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突