盧明智 劉芳 方旭 邊云 邵成偉 陸建平 李晶

1海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射治療科,上海 200433;2海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射診斷科,上海 200433

胰腺癌是一種對放化療敏感性差、手術(shù)切除率低的致死性惡性腫瘤[1-2],亟需新的系統(tǒng)治療手段出現(xiàn)。近年來,以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫治療雖然在實體腫瘤中取得一定的進(jìn)展[3-4],但在胰腺癌的應(yīng)用中卻令人失望[5-6],這可能與胰腺癌復(fù)雜的免疫抑制性微環(huán)境有關(guān)。腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)是存在于腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群體,其不僅是體內(nèi)免疫系統(tǒng)對腫瘤局部免疫應(yīng)答的直接反應(yīng),也是腫瘤免疫微環(huán)境的主要組成部分[7]。其中CD8+T細(xì)胞的存在與對免疫檢查點抑制劑療法的強(qiáng)力應(yīng)答相關(guān)。此外,有研究表明富含CD8+T細(xì)胞的患者對放化療的應(yīng)答效果更好[8]。已有研究證實在多種實體瘤(包括胰腺癌)中CD8+T細(xì)胞是重要的預(yù)后因素[9]。因此CD8+T細(xì)胞數(shù)量對患者預(yù)后以及治療策略的制定均有一定的臨床價值。目前術(shù)前檢測CD8+T細(xì)胞數(shù)量的主要方法為采用穿刺活檢,其局限性是獲得的標(biāo)本量極少,不能反映腫瘤的整體情況。而影像組學(xué)可從醫(yī)學(xué)圖像中提取高通量特征并分析腫瘤信息,能夠?qū)Σ∽儓D像進(jìn)行全面精準(zhǔn)的評價,而且具有無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)和快捷等優(yōu)勢[10-13]。本研究旨在探討基于MRI圖像影像組學(xué)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型評估胰腺癌CD8+T細(xì)胞浸潤的可行性,期望有助于篩選可以從免疫治療中獲益的胰腺癌患者。

資料與方法

一、一般資料

回顧性收集2017年1月至2018年4月間海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院156例經(jīng)手術(shù)病理證實為胰腺癌患者的臨床、影像、病理及隨訪資料。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者接受手術(shù)切除,術(shù)后病理為胰腺導(dǎo)管腺癌;(2)術(shù)前7 d內(nèi)行標(biāo)準(zhǔn)MRI增強(qiáng)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)前接受過放療、化療或放化療的患者;(2)術(shù)后病理未進(jìn)行免疫組織化學(xué)CD8染色;(3)存在MRI無法顯示的胰腺病變以及圖像質(zhì)量不滿足分析要求。依據(jù)國際預(yù)測模型建模共識,按照時間順序?qū)?017年1月至12月共116例患者納入訓(xùn)練集,2018年1月至4月共40例納入驗證集。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號:CHEC-Y2020-011)。

二、MRI掃描方法

患者于MRI檢查前6 h禁食禁水。MRI設(shè)備為美國GE公司Signa HDxt 3.0 T、美國GE公司Discovery 750 3.0 T掃描儀和8通道體部線圈。掃描序列:(1)橫斷面呼吸觸發(fā)脂肪抑制快速自旋回波T2WI序列。重復(fù)時間(time of repetition, TR)6 316 ms,回波時間(time of echo,TE)85 ms,層數(shù)20,層厚5 mm,層間距1 mm,視野440 mm×440 mm,矩陣224×320。(2)肝臟快速容積成像(liver acquisition with volume acceleration,LAVA)T1WI序列。TR 2.58 ms,TE 1.18 ms,層厚5 mm,無層間距,視野440 mm×440 mm,矩陣224×320。增強(qiáng)掃描采用高壓注射器以2.0 ml/s的流率經(jīng)前臂靜脈注入對比劑釓噴替酸葡甲胺(Gd-DTPA)0.2 ml/kg,注射結(jié)束后用20 ml生理鹽水以同樣流率沖洗。分別在注射對比劑后15、20、40 s行動脈期、門靜脈期、延遲期掃描。

三、圖像分析

由2名具有10年以上腹部影像診斷經(jīng)驗的放射科醫(yī)師在臨床和病理學(xué)診斷不知曉的情況下采用盲法閱片,意見不同時,協(xié)商達(dá)成一致。觀察指標(biāo)包括:腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤T1W及T2W圖像的信號強(qiáng)度(與周圍胰腺組織相比)、腫瘤和血管的關(guān)系、胰腺是否有炎癥、是否伴有主胰管截斷和擴(kuò)張(直徑>3 mm)及膽管截斷和擴(kuò)張(直徑>10 mm)、胰腺實質(zhì)有無萎縮、胰腺輪廓有無異常、胰腺是否有囊腫等。

四、影像組學(xué)分析和預(yù)測模型構(gòu)建

影像組學(xué)分析的過程包括MRI圖像分割、組學(xué)特征提取、組學(xué)特征降維。選取T1W、T2W以及3期動態(tài)增強(qiáng)原始橫斷面圖像進(jìn)行分析。

采用3D Slicer 4.8.1軟件對胰腺腫瘤進(jìn)行分割。為降低采集條件差異的影響,在提取特征前對圖像進(jìn)行歸一化處理。為評價特征的穩(wěn)定性,使用簡單隨機(jī)化法抽取50例患者的圖像,由2名放射科醫(yī)師分別對感興趣區(qū)(region of interest,ROI)進(jìn)行勾畫、測量,計算觀察者間組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient,ICC);由1名放射科醫(yī)師間隔1周再次勾畫腫瘤,計算觀察者內(nèi)ICC。當(dāng)觀察者間與觀察者內(nèi)ICC均>0.75,認(rèn)為一致性良好,所提取的影像組學(xué)特征可靠,數(shù)據(jù)可以用作后續(xù)分析。

組學(xué)特征提取采用Python 1.2.0軟件。提取的組學(xué)特征包括原始特征和濾波器特征,其中濾波器特征包括拉普拉斯高斯濾波、小波分析、平方值、平方根、對數(shù)和指數(shù)特征6類。每一類特征值所包括的具體特征有一階統(tǒng)計量、形狀特征、三類紋理特征,合計1 409個。先分別剔除組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義和無顯著相關(guān)的組學(xué)特征,再通過最小絕對收縮和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,Lasso)進(jìn)一步對高維的組學(xué)特征進(jìn)行降維和選擇,最后根據(jù)Lasso回歸方程公式計算每位患者的組學(xué)分值(radscore),建立極端梯度提升(eXtreme gradient boosting,XGBoost)預(yù)測模型,模型包含的變量為MRI特征和組學(xué)分值。

五、病理學(xué)圖像分析

使用免疫組織化學(xué)法評價腫瘤CD8+T細(xì)胞數(shù)量。將CD8染色切片通過掃描儀(NanoZoomer S60,Hamamatsu Healthcare,japan)轉(zhuǎn)換為數(shù)字病理圖像。由1名病理科醫(yī)師對切片內(nèi)的腫瘤區(qū)域進(jìn)行標(biāo)注,注意避開正常胰腺、胰周脂肪及十二指腸,使用數(shù)字顯微鏡分析平臺(Visiopharm)對標(biāo)注區(qū)進(jìn)行細(xì)胞識別和計數(shù),自動計算出CD8染色陽性的細(xì)胞密度。

根據(jù)病理學(xué)診斷報告,記錄:(1)根據(jù)第8版美國癌癥聯(lián)合委員會TNM分期手冊評估T和N分期;(2)分化程度;(3)十二指腸有無侵犯;(4)膽總管有無侵犯;(5)脈管內(nèi)癌栓浸潤;(6)胰周神經(jīng)侵犯。

六、隨訪

以手術(shù)當(dāng)天為隨訪開始時間,截止時間為2020年8月1日。任何原因引起的死亡定義為事件發(fā)生,該時間段為總生存時間,隨訪過程中的失訪按截尾數(shù)據(jù)處理。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、CD8+T細(xì)胞高、低組的臨床、病理和影像學(xué)特征比較

根據(jù)X-Tile確定的CD8+T細(xì)胞水平截點值為19.09%(圖1A、1B),將83例CD8>19.09%者歸入高CD8+T細(xì)胞組,73例CD8≤19.09%者歸入低CD8+T細(xì)胞組(圖1C),兩組CD8表達(dá)水平分別為(28.06±8.72)%和(14.48±2.93)%。隨訪至2020年8月1日,高CD8+T細(xì)胞組死亡人數(shù)43例,低CD8+T細(xì)胞組死亡人數(shù)31例,兩組中位總生存時間分別為25.51和22.92個月,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007,圖1D)。訓(xùn)練集中T分期(P=0.027)和驗證集中MRI圖像測量的腫瘤大小(P=0.041)與CD8+T細(xì)胞浸潤程度有關(guān),其余臨床、病理、影像學(xué)特征差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05,表1)。

表1 胰腺癌患者的臨床、病理及影像學(xué)特征基線資料

圖1 胰腺癌患者生存數(shù)據(jù)的X-Tile分析。1A、1B 由X-Tile確定的CD8+ T細(xì)胞的最佳截斷值為19.09%;1C 依據(jù)截斷值19.09%,將患者分為高CD8+ T細(xì)胞組和低CD8+ T細(xì)胞組;1D CD8+ T細(xì)胞高、低組患者的Kaplan-Meier曲線

二、影像組學(xué)分析結(jié)果

50例患者間ICC為0.81～0.90,患者個體內(nèi)ICC為0.83～0.91,表明一致性均良好。

從T1WI、T2WI、動脈、門靜脈和延遲期圖像中總計提取的1 409個影像組學(xué)特征經(jīng)過組間方差分析、Person相關(guān)分析后,獲得79個顯著相關(guān)的組學(xué)特征,經(jīng)Lasso回歸降維至19個組學(xué)特征(圖2A、2B)。通過Lasso回歸公式獲得組學(xué)分值(表2)。高CD8+T細(xì)胞組的組學(xué)分值為-0.43(范圍:-1.55～0.65),低組的組學(xué)分值為0.22(范圍-0.68～2.54),兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖2C)。

表2 Lasso回歸篩選的影像組學(xué)特征與組學(xué)方程式

圖2 Lasso回歸特征降維。2A λ參數(shù)與變量的選擇路徑圖;2B λ參數(shù)和模型誤差;2C 經(jīng)Lasso回歸降維后的19個組學(xué)特征誤差條形圖

三、機(jī)器學(xué)習(xí)模型的構(gòu)建和性能驗證

將腫瘤大小和組學(xué)分值納入XGBoost模型。在訓(xùn)練集中,XGBoost模型預(yù)測胰腺癌CD8+T細(xì)胞浸潤程度的AUC值、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為0.90(95%CI0.85～0.95)、75.47%、90.48%、0.84、0.87和0.81。在驗證集中,XGBoost模型預(yù)測胰腺癌CD8+T細(xì)胞浸潤程度的AUC值、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為0.79(95%CI0.63～0.96)、90.00%、80.00%、0.85、0.82和0.89(圖3A)。校準(zhǔn)曲線顯示訓(xùn)練集(P=0.767)和驗證集(P=0.101)模型擬合度均較好(圖3B)。圖4為臨床實際應(yīng)用中的2個病例。利用預(yù)測模型可以準(zhǔn)確區(qū)分胰腺癌CD8+T細(xì)胞高、低組患者。

圖3 基于XGBoost分類器的訓(xùn)練集和驗證集的ROC曲線(3A)和校準(zhǔn)曲線(3B)

圖4 男性,60歲,胰腺癌,高CD8+T細(xì)胞組患者。CD8免疫組織化學(xué)染色圖像,紅色為CD8染色陽性細(xì)胞(4A,×20);胰腺癌MRI圖像感興趣區(qū)勾畫示意圖(4B);XGBoost分類器預(yù)測該患者為低CD8+T細(xì)胞組的概率為32.50%(4C)。男性,50歲,胰腺癌,低CD8+T細(xì)胞組患者。CD8免疫組織化學(xué)染色圖像,紅色為CD8染色陽性細(xì)胞(4D,×20);胰腺癌MRI圖像感興趣區(qū)勾畫示意圖(4E);XGBoost分類器預(yù)測該患者為低CD8+T細(xì)胞組的概率為92.20%(4F)

討 論

免疫治療給惡性腫瘤的治療帶來曙光。對胰腺癌患者免疫狀態(tài)的充分評估可以幫助臨床醫(yī)師篩選出免疫治療獲益患者,以延長生存,獲得更好預(yù)后。本研究以病理學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),基于腫瘤大小和影像組學(xué)特征建立的機(jī)器學(xué)習(xí)模型為指導(dǎo)臨床治療提供了重要的預(yù)測信息。

在目前的臨床實踐中,胰腺癌患者預(yù)后評估主要依靠TNM分期系統(tǒng),但TNM分期不能反映患者之間的異質(zhì)性[14],因此,即使相同疾病分期的患者,其預(yù)后也存在較大差異。盡管一些用于胰腺癌預(yù)后評價的生物化學(xué)和遺傳生物標(biāo)志物取得研究進(jìn)展,但它們受限于高成本和操作復(fù)雜性等束縛,因此,在胰腺癌患者中開發(fā)一種新的個性化預(yù)測模型具有重要的臨床應(yīng)用價值。越來越多的證據(jù)支持腫瘤微環(huán)境中的CD8+T細(xì)胞與胰腺癌的預(yù)后密切相關(guān)[15-21],而活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可通過識別腫瘤特異性抗原發(fā)揮免疫殺傷作用[22-23]。因此,定量CD8+T細(xì)胞可用來預(yù)測患者的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示,高CD8+T細(xì)胞組患者的總體生存期顯著長于低CD8+T細(xì)胞組,也證實了這一相關(guān)性。

CD8+T細(xì)胞的定量分析依賴于病理學(xué),但病理醫(yī)師閱片主要根據(jù)其知識儲備和臨床經(jīng)驗,存在一定的主觀性,不能精確地定量診斷,且術(shù)前活檢組織樣本量小并具有異質(zhì)性;而常規(guī)術(shù)前影像圖像對腫瘤評價均是基于解剖學(xué)和生物學(xué)評價,很難與病理微觀成分建立聯(lián)系。本研究通過對腫瘤進(jìn)行三維勾畫并提取影像組學(xué)特征,能夠更直觀、便捷且無創(chuàng)地觀察腫瘤的總體特征,這一點對于無法切除的胰腺癌患者尤為重要。Sun等[9]構(gòu)建了基于CT的影像組學(xué)模型評估15種實體腫瘤(但未包括胰腺癌)中CD8+T細(xì)胞浸潤程度,并可預(yù)測免疫治療的療效。Liao等[12]基于CT圖像篩選7個組學(xué)特征構(gòu)建的組學(xué)分值可以預(yù)測原發(fā)性肝癌患者的生存結(jié)局、CD8+T細(xì)胞浸潤程度、免疫表型和PD-1/PD-L1表達(dá)。在胰腺癌方面,Li等[24]發(fā)現(xiàn)基于CT的影像組學(xué)模型在評估腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞的訓(xùn)練集和驗證集的AUC值分別為0.75和0.67。本研究基于MRI的機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測模型在訓(xùn)練集(AUC值為0.90)和驗證集(AUC值為0.79)中均具有較高診斷效能。與CT相比,MRI成像具有軟組織分辨率高、多序列多參數(shù)成像的優(yōu)勢。

本研究存在一些不足之處。第一,本研究為單中心回顧性研究,未來需納入多中心數(shù)據(jù)做驗證集;第二,只納入了手術(shù)后患者,不可避免的存在偏倚;第三,由于胰腺癌呈浸潤性生長,邊緣較模糊,本研究仍采用手工勾畫腫瘤感興趣區(qū),存在勾畫者間的經(jīng)驗差異,導(dǎo)致可重復(fù)性差,且耗時費(fèi)力,未來可借助人工智能算法實現(xiàn)腫瘤的全自動分割。

綜上所述,基于MRI影像組學(xué)特征的機(jī)器學(xué)習(xí)模型在預(yù)測胰腺癌CD8+T細(xì)胞浸潤上具有較高價值,有助于篩選可以從免疫治療中獲益的患者。但本研究僅探討了CD8+T細(xì)胞,而胰腺癌的腫瘤微環(huán)境組成復(fù)雜,且各組分間存在交互作用,因此該指標(biāo)在臨床預(yù)后評估的價值仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明盧明智:研究操作、論文撰寫;劉芳、方旭:數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析; 李晶、邊云:研究醞釀、研究指導(dǎo)、工作支持;邊云、邵成偉、李晶、陸建平:研究設(shè)計、研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持