宋凌燕，王亞飛，王敏，薄紅霞，郭旭霞

(長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院，山西 長治 046000)

結(jié)核病目前仍是危害人類健康的重大傳染病，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的出現(xiàn)和流行是目前全球結(jié)核病控制的重大挑戰(zhàn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2018年發(fā)布的數(shù)據(jù)[1]，中國結(jié)核病患病率占全球的9%，因此加強結(jié)核分枝桿菌耐藥性的研究尤其重要。耐藥基因檢測可以快速、準確獲得患者的分子藥敏試驗結(jié)果，有利于早期治療。目前，利福平和異煙肼作為抗結(jié)核的一線藥物，具有殺菌力強、不良反應(yīng)少、價格便宜等優(yōu)點，本研究通過熔解曲線法分析長治地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼這兩種藥物的耐藥率及耐藥基因突變位點，以期給利福平和異煙肼抗結(jié)核病的臨床應(yīng)用研究提供客觀依據(jù)。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年2月—2019年8月住院患者結(jié)核分枝桿菌涂片陽性的痰液及分離培養(yǎng)的純結(jié)核分枝桿菌株標本363 例，其中男250 例，女113 例，年齡14～89 歲。

1.2 標本收集及結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸提取

1.2.1 痰液樣本

留取患者痰液涂片抗酸染色陽性(2+以上)的痰液標本，以1∶1比例加入4%NaOH，混勻，液化20 min以上，3 000 r/min，離心20 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸沉淀，3 000r/min，離心10min，棄上清，1mL生理鹽水重懸沉淀，12000 r/min，離心5 min，棄上清，加入250 μL結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸(TBDNA)提取液，99℃加熱20min，12000r/min，離心5min，上清液為待測TB DNA樣本。

1.2.2 純結(jié)核分枝桿菌菌株

留取改良羅氏培養(yǎng)基上生長的典型結(jié)核分枝桿菌，刮取適量的菌落加入到250 μL TB DNA提取液中，99 ℃加熱20 min，12 000 r/min，離心5 min，上清液為待測TB DNA樣本。

1.3 熔解曲線法

嚴格按照廈門致善生物科技有限公司結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥突變試劑盒說明書進行樣本的檢測和結(jié)果的判讀。吸取5 μL上述提取完成的TB DNA，加入到含20 μL聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的反應(yīng)管中，放入SLAN-96S實時熒光PCR擴增儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)進行擴增和熔解曲線分析。

1.3.1 PCR反應(yīng)程序：

50 ℃ 2 min，1個循環(huán)；預(yù)變性95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，70 ℃ 20 s(每個循環(huán)下降1 ℃)，76 ℃ 25 s，13個循環(huán)；95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25s，42個循環(huán)。熔解分析：95℃ 2min，40℃ 2 min，45～85 ℃(設(shè)置在此階段每1 ℃采集1次熒光信號)，1個循環(huán)。

1.3.2 結(jié)果判讀

當(dāng)樣本的熔解溫度(Tm)與陽性對照的Tm一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型，即試驗菌株對利福平/異煙肼敏感；樣本的Tm與陽性對照Tm相差2 ℃及以上時判定為突變型，即試驗菌株對利福平/異煙肼耐藥。

1.4 觀察指標

統(tǒng)計結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥率以及兩種藥物不同耐藥突變位點發(fā)生頻率。

2 結(jié) 果

結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼同時耐藥的樣本有63 例，耐藥率為17.4%。單利福平耐藥率為19.6%(71/363)，其中ropB(codon 507-512)，ropB(codon 521-528)，ropB(codon 513-520)，ropB(codon 529-533)突變頻率分別為4.4%(16/363)，4.7%(17/363)，3.0%(11/363)和10.5%(38/363)；主要突變基因片段為ropB 529-533片段，另有3 例產(chǎn)生ropB codon 533特殊突變；傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗顯示對利福平敏感。單異煙肼耐藥率28.1%(102/363)，其中AhpC啟動子區(qū)(-44～-30位點)、AhpC啟動子區(qū)(-15～3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點)、KatG315密碼子的突變頻率分別是0(0/363)，3.3%(12/363)，0(0/363)，7.2%(26/363)和21.2%(77/363)，主要突變基因仍是inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點)和KatG315密碼子。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌耐藥原因主要是基因、藥物激活基因的啟動子突變或者是藥物靶點序列發(fā)生了突變。利福平耐藥主要發(fā)生在ropB基因中一個大小為81個堿基對的利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)，95%以上的利福平耐藥與此有關(guān)。利福平能抑制結(jié)核桿菌DNA依賴的RNA聚合酶活性，RNA聚合酶失活引起轉(zhuǎn)錄停止，結(jié)核分枝桿菌不能繼續(xù)生長。大部分利福平耐藥菌都是由于編碼RNA聚合酶b亞基的基因某個特定區(qū)域發(fā)生突變[2]，從而不再與利福平結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。異煙肼耐藥主要與katG，inhA，ahpC等基因中的1個或多個突變有關(guān)[3]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥基因位點在ropB的529-533片段，異煙肼的耐藥位點主要為inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點)和KatG315密碼子，同時異煙肼的耐藥率明顯高于利福平，與國內(nèi)一些研究報道相似[4-7]。2018年WHO報告[1]，利福平敏感菌株的異煙肼耐藥率與2017年全球的耐多藥/利福平耐藥率相比，初治患者中前者明顯高于后者(7.1%和3.5%)；但復(fù)治患者中前者明顯低于后者(7.9%和18.0%)。Yuen等[8]通過對32個國家和地區(qū)的兒童結(jié)核病患者進行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)：兒童結(jié)核病患者中異煙肼耐藥率高達12.1%，且大部分集中在西太區(qū)和東南亞地區(qū)。異煙肼耐藥結(jié)核病在全球范圍內(nèi)處于一個比較嚴重的流行狀態(tài)。

本研究仍存在一定的局限和不足。本研究是臨床數(shù)據(jù)的總結(jié)，未對初治和復(fù)治進行分組；采用的是商品化試劑，僅對試劑包含的突變位點進行了分析總結(jié)，未能分析是否存在其他相關(guān)突變位點；研究對象數(shù)量有限，雖包含了各縣及市區(qū)送來的樣本，但總體送檢率偏低，所以數(shù)據(jù)結(jié)果可能有偏倚。

綜上所述，ropB 529-533，katG，inhA 3個耐藥基因位點為突變頻率較高的位點。耐藥基因不同位點突變率在人群中存在一定差異，對臨床診斷和選擇調(diào)整耐藥結(jié)核病患者治療方案有一定的指導(dǎo)意義。本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥率仍然較高，其中異煙肼耐藥是個不容忽視的問題。